Проектирование и строительство искусственного внеклеточного матрикса (aECM) Белки Кишечная палочка Для кожи тканевой инженерии

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы продемонстрировать шаги, связанные с конструированием и производством искусственных белков ВКМ или ВКМ, содержащих эластиноподобные повторы. Это достигается путем создания сначала рекомбинантных генов, которые кодируют белки A ECM. Далее рекомбинантные гены встраиваются в бактериальных хозяев.

На этом этапе рекомбинантные белки экспрессируются в бактериальных хозяевах, а затем собираются после экстракции белка путем лизиса клеток. Последним шагом является очистка белков с помощью обратного цикла перехода или ITC, который использует уникальное свойство эластина при фазовом переходе. Как полипептиды.

Циклы центрифугирования выполняются при температуре от четырех до 37 градусов по Цельсию. В конечном счете, гель-электрофорез и методы вестерн-блоттинга используются для идентификации рекомбинантных белков и определения их чистоты. Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как аффинные колонки, заключается в том, что мы можем извлекать большое количество белков относительно дешево.

Начните эту процедуру со всей конструкции связок, как описано в текстовом протоколе. После того, как олигомеры получены, аннулируйте олигомеры ДНК для получения желаемой последовательности генов. Сначала растворите олигонуклеотиды ДНК в олигонуклеотидах ДНК до конечной концентрации один микрограмм на микролитр.

Добавьте по четыре микролитра каждой связки к 32 микролитрам ДНК и буферу для колена, чтобы получить общую смесь 40 микролитров. Затем вскипятите стакан с водой с помощью горячей плиты и погрузите смесь на пять минут. При температуре 95 градусов по Цельсию снимите стакан и постепенно охладите всю установку в пенопластовой коробке в течение ночи, олигомеры теперь стоят на коленях и готовы к перевариванию.

Добавьте соответствующие ферменты рестрикции для расщепления аль-олигомеров и переносчиков хозяина по отдельности, как описано в текстовом дайджесте протокола, в течение трех-четырех часов при температуре 37 градусов Цельсия. После запуска продуктов распада на агарозном геле и очистки ДНК последовательно объедините интересующий ген путем лигирования расщепленной вставки ДНК в плазмидный вектор с Т-4-лигазой. Используя рецепт, найденный в текстовом протоколе, инкубируйте лигаторную смесь при комнатной температуре в течение двух часов.

Далее трансформируем клетки с помощью теплового шока по Али. Вычисление 50 микролитров компетентных ячеек в чистые предварительно охлажденные микроцентрифужные пробирки. Внесите пипеткой пять микролитров смеси для лигирования в клетки, аккуратно пипетируя вверх и вниз, чтобы перемешать.

Оставьте смесь на льду на 20 минут. Затем погрузите микроцентрифужную пробирку, содержащую клеточную смесь, в водяную баню при температуре 42 градуса Цельсия на две минуты и верните на лед на две минуты. Добавьте 500 микролитров среды SOC в микроцентрифужную пробирку и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия с встряхиванием в течение часа.

После инкубации рассыпьте от 50 до 500 микролитров смеси для лигирования клеток на двухкратную YT-шнековую пластину, содержащую ампициллин, предварительно нагретый до комнатной температуры. Инкубируйте пластины вверх дном при температуре 37 градусов Цельсия на ночь. На следующий день отоберите колонии ДНК из шнековой пластины с помощью чистых наконечников для пипетки.

Выращивают колонии в пять миллилитров в два раза. YT-среды, содержащие ампициллин, в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия в течение ночи с встряхиванием на следующий день. Используйте набор для выделения плазмид в соответствии с протоколом производителя для извлечения плазмид ДНК для каждой колонии.

Подбирают элюирование, ДНК с 50 микролитрами воды после превращения рекомбинантной плазмиды в бактериальную экспрессию хозяина, как описано в текстовом протоколе. Выберите колонию из преобразованной пластины шнека с помощью наконечника пипетки инокулянтной. 10 миллилитров стерильного, потрясающего бульона или противотуберкулезной среды, содержащей антибиотики ампициллин и хлорамфеникол в пробирке.

Инкубируйте эту закваску при температуре 37 градусов Цельсия в течение ночи с встряхиванием при 225 об/мин. Затем перелейте 10 миллилитров закваски в один литр свежей и стерильной противотуберкулезной среды. Дополняется теми же антибиотиками в трехлитровой колбе эрлина Мейера.

Инкубируйте культуру при 37 градусах Цельсия с встряхиванием при 225 РРЦ М в течение двух-трех часов. Наблюдайте за оптической плотностью культуры на расстоянии 600 нанометров или наружным диаметром 600, чтобы подтвердить, что она достигла от 0,6 до 0,8, путем пипетирования одного миллилитра культуры в пустой ветеринарный тест Q для чтения. Затем индуцируют культуру с помощью IPTG до конечной концентрации в один миллимоляр и инкубируют при 37 градусах Цельсия с встряхиванием при 225 об/мин в течение еще четырех часов.

Соберите клетки путем переноса культуры в литровую центрифугу, бутылки и центрифугирования при 12 000 G в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия. После сброса надосадочной жидкости взвесьте клеточные гранулы и повторно суспендируйте в 10 буферных сред по 0,5 грамма на миллилитр. Заморозьте ресуспендированную клеточную культуру при температуре минус 80 градусов Цельсия на ночь.

На следующий день разморозьте замороженную культуру клеток на водяной бане комнатной температуры или на льду. К L клеткам добавляют дезоксирибонуклеазу, одну рибонуклеазу А и фенилметилсуен фторид. Размораживая раствор, гомогенизируйте раствор при медленном помешивании.

После того, как все ресуспендированные клетки будут разморожены, отрегулируйте раствор до pH 9,0, чтобы очень осторожно повысить растворимость белка в воде. Добавляем шесть N гидроксида натрия по каплям при помешивании на льду до достижения однородной консистенции. Затем вшейники подвергаются ультразвуковому воздействию в течение 20 минут на льду, используя плоский кончик диаметром два миллиметра и пятисекундный импульс.

Центрифугируйте раствор ячейки при давлении 12 000 G в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия. Переложите супернат в чистую пустую бутылку и храните при температуре четыре градуса Цельсия для последующей очистки. Тем временем снова суспендируйте клеточную гранулу с 10 буфером и сэкономьте 20 микролитров клеточного лизата.

Для определения характеристик страницы SDS повторно заморозьте ресуспендированную клеточную гранулу при температуре минус 80 градусов Цельсия для завершения лизиса клеток. Повторите процесс замораживания, размораживания и обработки ультразвуком до трех раз. Кольцевают клеточный лизат из более ранних и приступают к очистке белков A ECM с помощью ITC, в котором циклы центрифугирования выполняются при различных температурах в условиях высокого содержания солей.

Разделите лизат клеток на 50-миллилитровую центрифугу, флаконы и центрифугу при 40 000 G в течение двух часов при четырех градусах Цельсия. Удалите надосадочную жидкость с помощью пипетирования, чтобы получить чистое отделение от гранулы. Соберите надосадочную жидкость в чистые бутылки центрифуги и добавьте хлорид натрия до конечной концентрации в один моляр.

Прогрейте раствор до 37 градусов Цельсия в течение двух часов с встряхиванием при 225 об/мин. Далее центрифуга. Надосадочная жидкость при 40 000 G в течение двух часов при 37 градусах Цельсия.

После декантации надосадочная жидкость измельчает гранулу с помощью металлического шпателя и повторно суспендирует кусочки гранул во льду. Холодный автоклав дистиллируют воду при энергичном перемешивании в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия с помощью магнитной мешалки и пластины до полного растворения гранул. Повторяйте эти циклы до тех пор, пока гранула при температуре 37 градусов Цельсия не станет белой, после чего ее можно растворить в воде на ночь и центрифугировать.

Чтобы получить белковый раствор, обессолите белковый раствор путем его диализа по сравнению с дистиллированной водой при температуре четыре градуса Цельсия, меняя воду каждые четыре часа или восемь часов на ночь в течение двух-трех дней после сохранения 20 микролитров очищенного белка для SDS. Интенсивная белковая полоса находится на прогнозируемой молекулярной массе в индуцированном образце. Также показана страница SDS gel, содержащая образец очищенного белка с молекулярной массой 22 килодальтоны, соответствующей ламинину пяти А ECM.

Расчетная чистота белков A ECM составляет от 90 до 95%Это значение было получено путем сравнения соотношений интенсивностей полос целевого белка и других белковых полос, присутствующих на геле SDS. Наконец, чтобы определить, действительно ли очищенный белок является белками А ECM, здесь был проведен вестерн-блоттинг. Чистота белка трех белков A ECM показана с помощью геля на странице SDS и сравнена с изображением нитроцеллюлозной мембраны для вестерн-блоттинга.

В результате анализа выявлено наличие белков-мишеней коллагена четырех А ВКМ и ламината пяти А ВКМ, меченных с помощью антител антигекса-гистидиновой метки, конъюгированных с пероксидазой хренской редьки. Конечный выход белков A ECM варьировался от 60 миллиграммов на литр до 120 миллиграммов на литр. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как сокращать и очищать белки, содержащие легкие домены эластина, для вашего конкретного применения.