Подавление BRCA2 Для идентификации новых BRCA2-биологические функции регулируются в культивируемых клетках человека

Сайленсинг генов с помощью миРНК представляет собой удобную экспериментальную стратегию для анализа BRCA2-зависимых биологических функций с немедленными последствиями для лучшего понимания биологии рака. Представлен метод эффективного подавления BRCA2, а также экспериментальная процедура обнаружения и количественной оценки изменений экспрессии белка BRCA2 методом иммуноблоттинга в клеточных линиях человека.

Общая цель этой процедуры заключается в подавлении экспрессии B RCA two путем трансфекции SIR A. Это достигается путем предварительного приготовления комплексов реагентов для трансфекции SIR A. Затем проводится первый раунд трансфекции путем добавления комплексов по каплям к монослою клеток, которые имеют 80% бегучести CO. Затем проводится второй раунд SIR и трансфекции с использованием более высокого соотношения SIR, А к реагентам для трансфекции.

Наконец, монослои клеток промывают ледяным PBS, и клетки лизируют при четырех градусах Цельсия с помощью буфера для лизиса на основе детергента. В конечном счете, анализ вестерн-блоттинга используется для того, чтобы показать, что B, RCA, два сайленсинга на уровне белка. Основное преимущество этого метода перед существующими методами заключается в том, что он позволяет эффективно подавлять гены, а также оптимально обнаруживать высокомолекулярные белки, такие как супрессор опухолей B RCA 2. Чтобы начать выращивание монослоев эпителиальных клеток человека при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в увлажненной камере, удалите питательную среду и используйте PBS комнатной температуры для промывания клеток.

Чтобы отсоединить клетки от планшета, добавьте два миллилитра 0,25% трипсина и 0,53 миллимолярного раствора ЭДТА и инкубируйте от трех до пяти минут в зависимости от типа клеток. Нейтрализуйте трипсин, добавив два миллилитра полной питательной среды, содержащей 10% FBS, перед переносом клеток в 15-миллилитровую пробирку. Поместите пробирки в вращающийся ротор ведра и центрифугируйте при давлении от 320 до 330 G и четырех градусах Цельсия в течение трех минут.

Используйте пять миллилитров среды, не содержащей антибиотиков, для ресуспендирования гранул, прежде чем использовать камеру для подсчета клеток или автоматизированную систему подсчета клеток. Затем поместите примерно от 0,5 до 10 до 10 на шесть клеток в двух миллилитрах среды, свободной от антибиотиков, в каждую лунку из шести луночных планшетов и инкубируйте в течение 24 часов до 80% контективности. После инкубации следует провести первый раунд трансфекции, разбавив шесть микролитров специфического реагента для трансфекции на основе липидов в 130 микролитрах восстановленной сывороточной среды.

Разведите три микролитра 10 микромолярной Sirna в 130 микролитрах восстановленной сывороточной среды. Соедините разведенную ирнку с разведенным реагентом для трансфекции и выдерживайте от пяти до 10 минут при комнатной температуре. Во время инкубации удалите среду из клеток и добавьте два миллилитра свежей среды без антибиотиков.

Разогрейте до 37 градусов по Цельсию. Далее по 250 микролитров миРНК трансфективные комплексы реагента в каждую лунку клеток в шестилуночный планшет. Затем инкубируйте клетки во влажном инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом.

Через 24 часа разведите пять микролитров 10 микромолярных ирнк в 130 микролитрах восстановленной сывороточной среды и приступайте ко второму раунду трансфекции, как только и демонстрируется. Высокая концентрация сарны во втором круге имеет важное значение для получения высокой эффективности Brca. Двойное молчание.

Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного-двух дней перед анализом, чтобы подготовить лизат клеток для иммуноблоттинга. Приготовьте свежий буфер для лизиса в соответствии с приведенным здесь рецептом. Удалите среду из клеток и добавьте два миллилитра на лунку ледяного PBS, чтобы промыть клетки.

После этого полностью снимите PBS с пластины и добавьте в каждую по 200 микролитров ледяного буфера для лизиса. Хорошо аккуратно поверните пластину, чтобы равномерно распределить буфер для лизиса и инкубируйте на ротаторе при температуре четыре градуса Цельсия в течение 15 минут. Затем с помощью скребка для клеток.

Соберите лизат клеток в микроцентрифужную пробирку на центрифуге для льда при температуре 17 900 G и четырех градусах Цельсия в течение 25 минут и соберите супернат для проведения иммуноблоттинг-анализа. Приготовьте рабочий буфер, разбавив 50 миллилитров 20 x трис ацетатного рабочего буфера SDS с 950 миллилитрами дистиллированной воды. Подготовьте образец следующим образом.

Добавьте 15 мкг общего клеточного лизата. Пять микролитров из четырех х образцов буфера, содержащего сульфат лития ESAL pH 8,42 микролитра 0,5 молярного DTT и буфер для лизиса до общего объема 20 микролитров. Денатурируйте образцы при температуре 55 градусов Цельсия в течение 10 минут.

Очень важно использовать эту температуру, так как белок b RCA 2 термочувствителен. Далее настройте электрофоретическую камеру в соответствии с инструкцией производителя. Затем загрузите образцы в 10 микролитров высокомолекулярного стандартного белка на сборный гель и работайте при напряжении 120 вольт в течение примерно двух часов.

Тем временем приготовьте буфер для переноса с 50 миллилитрами 20 x буфера, 100 миллилитрами 100% метанола и 850 миллилитрами воды. Активируйте мембрану из ПВДФ, замочив ее в 100% метаноле на пять минут. Промойте дистиллированной водой и отбалансируйте в буфере для переноса не менее пяти минут.

Замочите губки передаточного аппарата в буфере при температуре четыре градуса Цельсия до использования. Остановите пробег до того, как синий маркер массой 55 килодальтон покинет сборный гелеобразный слой, и соберите сэндвич, начиная с трех губок, смоченных в буфере для переноса. Затем одна трехмиллиметровая бумага пропитывается в буфере для переноса.

Затем добавьте гель, затем активированную мембрану PVDF, затем одну буферную бумагу марки 3М и, наконец, три смоченные губки. Поместите стек в аппарат и перенесите белки при 350 миллиамперах в течение четырех часов и четырех градусов Цельсия или при 180 миллиамперах и четырех градусах Цельсия в течение ночи. После переноса используйте TBS для промывки мембраны и заблокируйте на один час TBST и 5% обезжиренным сухим молоком.

Затем замените буфер девятью миллилитрами молочного буфера TBST, содержащего 30 микролитров поликлональных антител против BCA двух кроликов, и инкубируйте при температуре четыре градуса Цельсия в течение ночи. После использования TBST промыть мембрану трижды по 10 минут, каждый инкубировать фильтр в течение одного микролитра пероксидазы хрена конъюгированного против кроличьего вторичного антитела, разведенного в 10 миллилитрах молочного буфера TBST. После трехкратной промывки мембраны выполните люминесцентное иммунодетектирование КЕММА, следуя инструкциям производителя.

Визуализируйте полосы на пленках ECL с высоким разрешением, чтобы подтвердить специфичность B. rca. Двойное молчание. Скремблированную ирнку использовали бок о бок с B RCA и двумя ирнками, как показано здесь, как упоминалось ранее, важно провести второй раунд трансфекции ирнк с высоким соотношением ирнк к трансфекции, чтобы получить высокую эффективность сайленсинга B RCA A two.

Полученные здесь результаты показывают разницу в эффективности нокдауна между использованием низкого и высокого соотношения миРНК к трансфекции в зависимости от типа клетки. Оптимальное минимальное время для получения наивысшего уровня сайленсинга генов может варьироваться после второго раунда трансфекции миРНК, например, как показано на этом рисунке, 24 часа достаточно для клеток щитовидной железы NTHY, но необходимо до 48 часов для эффективного B RCA A два нокдауна в PNT один А клетки предстательной железы b RCA два сайленсинга достаточно стабильны до седьмого дня после второго раунда трансфекции. Как упоминалось ранее, денатурация клеточных лизатов при температуре выше 55 градусов Цельсия приводит к потере до 50% белка B RCA A two.

В этом эксперименте изучалась чувствительность клеток B RCA A two silenced PNT one A к ингибитору PARP рукапарибу после 24-часового лечения препаратом. Зависящее от времени снижение пролиферации клеток наблюдалось в B, RCA, двух обедненных PNT и одном A клетках по сравнению с контрольной группой. После просмотра этого видео у него должно быть хорошее понимание того, как заглушить длинные белки, кодирующие гены с помощью CRNA и как эффективно обнаруживать их белковый продукт с помощью оптимизированной процедуры иммуноблокина, помимо BRC 2.

Это вещество может быть применено ко многим другим сложным крупным белкам, особенно когда они экспрессируются в клетках на очень низких уровнях.