Подавление

Общая цель данной процедуры заключается в сайленсинге экспрессии B RCA two путем трансфекции SIR A. Это достигается путем предварительного приготовления комплексов SIR a с реагентом для трансфекции. Затем проводится первый раунд трансфекции путем покапельного добавления комплексов к монослою клеток, достигших 80% конфлюэнтности. После этого выполняется второй раунд трансфекции SIR a с использованием более высокого соотношения SIR A к реагенту для трансфекции.

Наконец, монослои клеток промывают ледяным PBS, после чего клетки лизируют при 4 °C с использованием буфера для лизиса на основе детергента. В завершение для подтверждения сайленсинга B RCA A two на уровне белка используется вестерн-блоттинг. Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими является обеспечение эффективного сайленсинга генов, а также оптимального детектирования белков с высокой молекулярной массой, таких как опухолевый супрессор B RCA two. Для начала, после выращивания монослоев эпителиальных клеток человека при 37 °C и 5% CO2 в увлажненной камере, удалите питательную среду и промойте клетки PBS комнатной температуры.

Для отделения клеток от планшета добавьте два миллилитра 0,25% раствора трипсина и 0,53 мМ EDTA и инкубируйте от трех до пяти минут в зависимости от типа клеток. Нейтрализуйте трипсин, добавив два миллилитра полной ростовой среды, содержащей 10% FBS, перед переносом клеток в пробирку объемом 15 миллилитров. Поместите пробирки в ротор с размашивающимися стаканами и центрифугируйте при 320–330 Gs и четырех °C в течение трех минут.

Используйте 5 mL среды без антибиотиков для ресуспендирования осадка, после чего подсчитайте количество клеток с помощью камеры Буркера или автоматической системы подсчета. Затем распределите примерно от 0,5 до 1 × 10⁶ клеток в 2 mL среды без антибиотиков в каждую лунку 6-луночного планшета и инкубируйте до достижения 80% конфлюэнтности в течение 24 часов. После инкубации приступите к первому раунду трансфекции, разведя 6 µL липидного реагента для специфической трансфекции siRNA в 130 µL среды с пониженным содержанием сыворотки.

Разведите 3 µL 10 µM S irna в 130 µL среды с пониженным содержанием сыворотки. Смешайте разведенную irna с разведенным реагентом для трансфекции и инкубируйте в течение 5–10 минут при комнатной температуре. Во время инкубации удалите среду из культуральных сосудов с клетками и добавьте 2 mL свежей среды без антибиотиков.

Предварительно прогрейте при 37 °C. Затем добавьте по 250 µL комплексов реагента для трансфекции siRNA в каждую лунку с клетками в шестилуночном планшете. После этого инкубируйте клетки в увлажненном инкубаторе при 37 °C в атмосфере 5% CO2.

Через 24 часа разведите 5 µL 10 µM siRNA в 130 µL среды с пониженным содержанием сыворотки и приступайте ко второму раунду трансфекции, как показано далее. Высокая концентрация siRNA во втором раунде необходима для обеспечения высокой эффективности двойного сайленсинга Brca.

Инкубируйте клетки при 37 °C в течение одного-двух дней перед анализом, чтобы подготовить клеточный лизат для иммуноблоттинга. Приготовьте свежий буфер для лизиса согласно приведенному здесь рецепту. Удалите среду из лунок и добавьте по 2 мл ледяного PBS в каждую лунку для промывки клеток.

Затем полностью удалите PBS из лунок и добавьте в каждую по 200 µL ледяного лизирующего буфера. Осторожно перемешайте содержимое лунок вращением планшета для равномерного распределения лизирующего буфера и инкубируйте на ротаторе при температуре 4 °C в течение 15 минут. Затем, используя скребок для клеток.

Соберите клеточный лизат в микроцентрифужную пробирку на льду, центрифугируйте при 17 900 G и 4 °C в течение 25 минут, после чего соберите супернатант для проведения иммуноблоттинга. Приготовьте электрофоретический буфер, разбавив 50 мл 20-кратного Трис-ацетатного SDS-буфера 950 мл дистиллированной воды. Подготовьте образец следующим образом.

Добавьте 15 µg общего клеточного лизата. Добавьте 5 µL 4х буфера для образцов, содержащего додецилсульфат натрия (SDS) pH 8.4, 2 µL 0.5 M DTT и лизирующий буфер до общего объема 20 µL. Денатурируйте образцы при 55 °C в течение 10 минут.

Крайне важно использовать эту температуру, так как белок b RCA two термочувствителен. Далее подготовьте электрофоретическую камеру в соответствии с инструкциями производителя. Затем внесите образцы по 10 µL стандарта белков с высокой молекулярной массой в готовый гель и проводите электрофорез при 120 В в течение примерно двух часов.

Тем временем приготовьте трансферный буфер, смешав 50 миллилитров 20-кратного трансферного буфера, 100 миллилитров 100% метанола и 850 миллилитров воды. Активируйте мембрану PVDF, погрузив ее в 100% метанол на пять минут. Промойте мембрану дистиллированной водой и выдержите в трансферном буфере для уравновешивания в течение не менее пяти минут.

Замачивайте губки переносящего устройства в буфере для переноса при температуре 4 °C до начала использования. Остановите электрофорез до того, как синий маркер 55 kDa выйдет из готового геля, и соберите «сэндвич», начав с трех губок, пропитанных буфером для переноса. Затем положите один лист бумаги толщиной 3 мм, насыщенный буфером для переноса.

Затем добавьте гель, затем активированную мембрану PVDF, затем один лист фильтровальной бумаги марки 3M, смоченный в буфере, и, наконец, три смоченные губки. Поместите стопку в аппарат и проведите перенос белков при силе тока 350 milliamps в течение четырех часов при температуре четыре degrees Celsius или при 180 milliamps и четыре degrees Celsius в течение ночи. После переноса промойте мембрану буфером TBS и проведите блокировку в течение одного часа с использованием TBST и 5%non-fat dry milk.

Затем замените буфер на 9 мл молочного буфера TBST, содержащего 30 µL поликлональных кроличьих антител anti BCA two, и инкубируйте при 4 °C в течение ночи. После трехкратной промывки мембраны буфером TBST по 10 минут каждый раз инкубируйте фильтр в течение одного часа с 1 µL вторичных антител anti-rabbit, конъюгированных с пероксидазой хрена, разведенных в 10 мл молочного буфера TBST. После трехкратной промывки мембраны проведите иммунодетекцию методом хемилюминесценции KEMMA в соответствии с инструкциями производителя.

Визуализируйте полосы на пленках ECL с высоким разрешением, чтобы подтвердить специфичность сайленсинга B rca. A. Скрамблированная irna использовалась параллельно с B RCA two irna, как показано здесь; как упоминалось ранее, важно провести второй раунд трансфекции irna с высоким соотношением irna к трансфекционному реагенту для достижения высокой эффективности сайленсинга B RCA A two.

Представленные результаты демонстрируют различие в эффективности нокдауна при использовании низкого и высокого соотношения siRNA к трансфекционному агенту в зависимости от типа клеток. Оптимальное минимальное время для достижения максимального уровня сайленсинга гена может варьироваться после второго раунда трансфекции siRNA; например, как показано на этом рисунке, 24 часов достаточно для клеток щитовидной железы NTHY, но для эффективного нокдауна B RCA A two в клетках предстательной железы PNT one A требуется до 48 часов. b Сайленсинг RCA two остается достаточно стабильным до седьмого дня после второго раунда трансфекции. Как упоминалось ранее, денатурация клеточных лизатов при температуре выше 55 °C приводит к потере до 50% белка B RCA A two.

В данном эксперименте изучалась чувствительность клеток PNT 1A с подавленным экспрессией BRC A2 к ингибитору PARP рукапарибу после 24-часового воздействия препарата. В клетках PNT 1A с дефицитом BRC A2 наблюдалось зависящее от времени снижение пролиферации клеток по сравнению с контролем. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как подавлять экспрессию длинных белок-кодирующих генов с помощью CRISPR/Cas9 и как эффективно определять их белковый продукт с помощью оптимизированной процедуры иммуноблоттинга, помимо BRC A2.

Данный метод может быть применен ко многим другим сложным крупным белкам, особенно в тех случаях, когда они экспрессируются в клетках на очень низком уровне.