Генерация и нескольких фенотипическая Скрининг высокого содержания Coxiella burnetii транспозонов мутанты

Общая цель этой процедуры заключается в выявлении в больших масштабах. Факторы COE участвуют в ключевых этапах инфекционного цикла, включая поступление в клетки-хозяева, генерацию бактериальной репликативной ниши и персистенцию. Это достигается путем предварительного создания библиотеки GF PT co-мутантов путем транспонирования на мутагенез.

Затем клетки-хозяева заражаются каждым изолированным мутантом. Затем внутриклеточная репликация каждого мутанта отслеживается в режиме реального времени с помощью считывателя микропланшетов, чтобы определить мутации, которые наиболее вредны для инфекции коксиеллы. Наконец, клетки, инфицированные коксиеллами, анализируются с помощью автоматизированной микроскопии.

В конечном счете, автоматизированный анализ изображений позволяет морфологически охарактеризовать каждый полученный фенотип, чтобы связать каждый мутировавший ген с предполагаемой функцией в инфекционном цикле коксиеллы. Этот метод может помочь решить ключевые проблемы в области взаимодействия патогенов хозяина, такие как крупномасштабная идентификация основных генов данного патогена, необходимых для взаимодействия со всей клеткой и использования ее молекулярных механизмов в своих интересах. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку гальванизация и изоляция колоний COE труднодостижимы.

Действительно, COE образует очень маленькие колонии, которые необходимо тщательно извлекать из мягких ACCM two aro. Как этот метод может дать представление о кокковой лабораторной инфекции. Его также можно применять к другим внутриклеточным патогенным бактериям, таким как сальмонелла, бурель, микобактерии и так далее.

После трансформации компетентных коксиелл с транспозоном и плазмидами, покрытыми транспозазой, в соответствии с текстовым протоколом, для выделения отдельных мутантов приготовьте донные аросы, смешав 10 миллилитров расплавленных 0,5%-ных арос с 10 миллилитрами двух X accm, двух в шкафу микробиологической безопасности или MSC и добавьте соответствующие антибиотики, немедленно вылейте в чашку Петри и дайте ей остыть без крышки в течение 30 минут, а затем высушите на воздухе в течение 20 минут. Чтобы приготовить верхнюю сумку, смешайте 1,25 миллилитров двух x accm two с 0,75 миллилитров воды в 15-миллилитровой полистирольной тубе. Добавьте соответствующие антибиотики и инкубируйте при температуре 37 градусов по Цельсию.

Затем добавьте один к 100 микролитрам бактериальной культуры и сделайте вихрь на пять секунд. Далее добавляем 0,5 миллилитра растопленной смеси арос и сразу же заливаем на дно арос. Дайте тарелке остыть в течение 20 минут.

Накройте крышкой и выдерживайте при температуре четыре градуса Цельсия в течение 20 минут, чтобы они затвердели. Затем снимите крышку и высушите тарелку на воздухе в течение 20 минут, прежде чем переложить в увлажненный инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия с 5% углекислого газа и 2,5% кислорода на шесть-семь дней. Как только колонии станут обнаруживаемыми, соберите их, отрезав конец наконечника пипетки объемом в один миллилитр и используя его для выделения пробок, содержащих одиночные колонии.

Затем перекладываем их в лунки на 24 лунки, содержащую 1,5 миллилитров accm two. После подготовки стандартной кривой, согласно текстовому протоколу, количественно оцените каждую бактериальную суспензию, дозируя пять микролитров 10% Triton X 100 на лунку. В микропланшет на 96 лунок с черными стенками и дном добавьте по 50 микролитров бактериальных суспензий в каждую лунку и выдерживайте в шейкере для тарелок в течение 10 минут.

При комнатной температуре используйте один буфер XTE для разбавления двухцепочечного реагента для количественного определения ДНК от одного до 200 и добавьте 55 микролитров разведенного реагента в каждый образец. В 96-луночном микропланшете с помощью вибростенда хорошо перемешанного перед инкубацией в темноте при комнатной температуре в течение двух-пяти минут, измерить флуоресценцию образцов с помощью флуоресцентного микропланшетного ридера и фильтров для стандартных длин волн флуоресцеина. Чтобы получить график концентрации бактериальной ДНК, показания флуоресценции на стандартной кривой, подготовленной ранее, делят концентрацию ДНК на массу генома коксиеллы для получения бактериальной концентрации.

Выразите результаты в эквивалентах генома на миллилитр после проведения ПЦР с колонией одиночного праймера и секвенирования ДНК по текстовому протоколу. Используя программное обеспечение для анализа последовательностей, загрузите полный аннотированный геном Coxiella Burnett I 4 93 NM one с функцией выравнивания по эталону, загрузите и совместите результаты секвенирования с помощью blast N и определите место транспозиции. После приготовления суспензии клеток Vero из 10-5 клеток на миллилитр в среде RPMI, согласно текстовому протоколу, дозируйте по 100 микролитров суспензии в каждую лунку черного 96-луночного планшета с плоским прозрачным дном, центрифугируйте планшет при 400-кратном G и комнате в течение пяти минут и инкубируйте при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа в течение ночи.

На следующий день опустить при комнатной температуре 96 лунки планшеты, содержащие мутанты коксиеллы, и развести 150 микролитров бактериальных суспензий в 300 микролитрах RPMI без фенолового красного и FBS в глубокой лунке 96 луночного планшета, затем удалить среду из клеток Vero и дозировать 100 микролитров на лунку разведенных мутантов коксиеллы. Используйте лунки А в качестве отрицательного контроля и лунки А два и три в качестве положительного контроля с помощью аэрозольного герметичного держателя центрифуги центрифугируйте планшет при 400 перегрузках и комнатной температуре в течение 10 минут. Затем, после инкубации планшета при температуре 37 градусов Цельсия во влажной атмосфере с содержанием углекислого газа 5% в течение двух часов, замените среду, содержащую бактерии, на 100 микролитров на лунку свежей полной среды RPMI с помощью считывателя флуоресцентных микропланшетов и фильтров для флуоресцеина.

Измеряйте флуоресценцию GFP каждый день в течение семи дней На седьмой день после заражения удалите среду из планшета и замените ее 50 микролитрами на лунку свежей полной среды, содержащей от одного до 1000 разбавлений проницаемого для клеток флуоресцентного красителя. Инкубируйте клетки от 30 до 60 минут после инкубации, замените среду на 50 мкл на лунку 4%-ной ПФА и инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 минут. Затем удалите буфер, содержащий PFA, прежде чем использовать PBS для трехкратной промывки После удаления окончательной промывки выдайте по 50 микролитров блокирующего раствора в каждую лунку и выдерживайте при комнатной температуре в течение 30 минут.

Затем замените блокирующий раствор на 40 микролитров на лунку, свежий блокирующий раствор и разведение одного к 500 противолампового антитела. После инкубации при комнатной температуре в течение 30 минут удалите раствор и с помощью пластинчатой мойки промойте лунки пять раз, внеся 100 микролитров PBS на лунку. Затем добавьте 40 микролитров на лунку блокирующего раствора, содержащего соответствующее флуоресцентное вторичное антитело и зацепленное 3 3 2 5 8 по пять микрограмм на миллилитр.

Выдерживать при комнатной температуре в течение 30 минут. Промойте образцы пять раз и оставьте окончательную промывку PBS в лунках, чтобы они не высыхали. Для получения изображений используется эпифлуоресцентный автоматический микроскоп, оснащенный объективом с 20 x и 3 4 88 5 55 и шестью 15 нанометровыми каналами.

Получите 21 независимое поле для каждой скважины, чтобы получить изображение минимум 5 000 клеток в образце. Примените автоматическую фокусировку, используя канал ядра клетки-хозяина в качестве эталона. Наконец, используйте автоматический анализ изображений для экстраполяции ряда релевантных особенностей полученных изображений.

На этом рисунке показано 38 транспонирование на мутантах в 16 точках ICM Coxe L в Genes aen кривые роста, которые оценивают жизнеспособность мутантов. Здесь. Внутриклеточные кривые роста мутантов коксиеллы, инкубированных с эпителиальными клетками, обеспечивают количественный анализ фенотипов, связанных с транспонированием вставок в геноме коксиеллы. На этом рисунке был выполнен автоматический сбор изображений для идентификации и характеристики ядер клеток-хозяев, клеточных контуров, лизосом и колоний коксиелл.

Корреляция колоний коксиелл с клетками и лизосомами позволяет провести морфологический анализ коксиелл-содержащих вакуолей. Корреляция колоний коксиелл с контурами клеток хозяина позволяет проводить морфологический анализ инфицированных клеток. Наконец, четыре канала объединяются.

Средняя площадь колоний коксиелл строится в зависимости от количества колоний на клетку с целью выявления мутаций, влияющих на внутриклеточную репликацию коксиелл и/или способность бактерий проникать в клетки-хозяева. Мутанты наблюдались в трех кластерах: мутации, влияющие на внутриклеточный рост интернализации coxiella coxiella в клетках и незначимые фенотипы. Здесь средняя площадь колоний коксиелл соотносится с числом клеток-хозяев, переживших инфекцию, чтобы выявить мутации, которые придают цитотоксичность коксиелле после ее развития.

Этот метод проложил путь исследователям в области бактериальных инфекций к изучению взаимодействий патогенов хозяина в больших масштабах и определил мишени хозяина и бактерии для разработки новых методов лечения инфекционных заболеваний.