Одновременный Экс естественных условиях Функциональное тестирование двух сетчатки по В естественных условиях Система электроретинограммы

Общая цель этой процедуры заключается в оценке функции клеток изолированной сетчатки мыши с помощью коммерческой системы in vivo, электроретинограммы или ERG вместе с адаптером ex vivo. Это достигается путем предварительного рассечения сетчатки обоих глаз мыши. Второй шаг заключается в установке фоторецептора сетчатки стороной вверх в держатель образца.

Затем держатель образца помещается на нагревательную пластину в системе ERG in vivo и подключается к перфузии под действием силы тяжести. Заключительным этапом является подключение электродов держателя образца к усилителю и стимуляция сетчатки светом для получения ответов ЭРГ. В конечном счете, ex vivo ERG используется для демонстрации того, как стержневые и колбочко-опосредованные сигнальные пути могут быть расчленены с помощью фармакологии и специализированных протоколов световой стимуляции.

Основное преимущество этой методики по сравнению с другими существующими методами, такими как in vivo, ERGs или запись одиночных клеток, заключается в том, что она обеспечивает более высокое соотношение сигнал/шум для более длительных и стабильных записей, а также возможность для простых и количественных фармакологических манипуляций. Кроме того, этот метод может быть использован для скрининга эффективности и безопасности препаратов, предназначенных для лечения заболеваний сетчатки у приматов и доноров сетчатки По крайней мере за один день до этого измените нижнюю часть держателя образца, приклеив немного черно-серой фильтровальной бумаги к верхней части куполов. Используйте двухкомпонентную пятиминутную эпоксидную смолу по краям куполов и, при необходимости, используйте микроскоп для препарирования После высыхания клея прижмите фильтровальную бумагу к куполу.

Его хватит примерно на месяц записи. Затем снимите бумагу и очистите купол 70% этанолом. Теперь, чтобы подготовить электрод, сначала заполните электродные каналы раствором электрода.

Старайтесь избегать попадания пузырьков воздуха. Затем вкрутите пеллетные электроды в электродные каналы. Соедините верхнюю и нижнюю части держателя образца четырьмя винтами и заполните линии перфузии раствором электрода.

Далее измерьте сопротивление и напряжение между выводами электродных пар. Сопротивление должно быть ниже 100 килоОм, а напряжение ниже 10 милливольт. Если каналы не содержат пузырьков и электроды находятся в хорошем состоянии, налейте от 400 до 700 миллилитров перфузионной среды в стеклянную бутылку для перфузии образца.

Также высыпаем 300 миллилитров для вскрытия и храним его в холодильнике. Затем пропустите перфузионную трубку через блок теплообменника и поместите предварительно нагретый блок на нагревательную пластину. Теперь бутылка закрыта крышкой, которая имеет входное отверстие для газа и входное отверстие для перфузионной трубки.

Входное отверстие для газа должно быть прикреплено к воздушному камню. Поставьте предварительно нагретую бутылку туда, где перфузионная среда будет поддерживаться при температуре 37 градусов Цельсия. Затем заправьте перфузионные линии, заполнив их перфузионной средой, чтобы инициировать гравитационный поток в системе OCUS Science.

Поместите бутылку внутрь клетки Фарадея, чтобы свести к минимуму шум и использовать длинные линии перфузии на выходе из держателя образца. Расположенные значительно ниже уровня держателя образца и перфузионного баллона, защитите эти выходные линии и соедините экран с землей усилителя через клетку Фарадея. Чтобы предотвратить связывание электромагнитного шума с сигналом ERG, прикрепите датчик температуры к нагревательному столику.

Теперь с помощью регуляторов отрегулируйте расход раствора до трех-пяти миллилитров в минуту. Наконец, при необходимости введите в раствор автомобиль и газ и отрегулируйте регулятор для постоянного потока пузырьков из воздушного камня. Начните с того, что вылейте около 200 миллилитров холодного перфузионного раствора в большую чашку Петри так, чтобы можно было полностью погрузить всю нижнюю часть держателя для образцов.

Усыпьте животное, выращенное в течение 12-12-часового цикла темноты, а затем адаптированное к темноте в течение 6-12 часов до записи. Все следующие процедуры должны выполняться под тусклым красным или инфракрасным светом. Изолировав каждый глаз, поместите их в глазную среду.

Затем перенесите один глаз на небольшой кусочек фильтровальной бумаги на бумаге. Обхватите его пинцетом и прорежьте в нем щель примерно на том же уровне, что и зубчатая аура из щели. Разрежьте вдоль зубчатой ауры или где-нибудь ближе к экватору, чтобы удалить роговицу и хрусталик.

Затем снимите роговицу и концы линз и перенесите наглазник обратно в холодную среду. Повторите ту же процедуру с другим глазом. Теперь, работая с наглазником, сделайте небольшой разрез сверху по направлению к зрительному нерву.

Держите ножницы между сетчаткой и склерами, чтобы сетчатка оставалась как можно более неповрежденной. Затем возьмитесь за склеру с обеих сторон разреза с помощью двух пинцетов и раздвиньте ткань, чтобы отделить сетчатку. Чтобы изолировать сетчатку, перережьте зрительный нерв и удалите сетчатку с минимальным контактом с ее дистальной поверхностью.

Теперь установите изолированную сетчатку на купола держателя образца. Сначала погрузите нижнюю часть держателя образца в чашку Петри с рассеченной сетчаткой. Следующий слайд.

Фоторецептор сетчатки или выпуклая сторона вверх над куполом. Затем осторожно поднимите держатель для образца так, чтобы сетчатка прикрепилась к фильтровальной бумаге. Затем повторите процедуру для другой сетчатки.

Теперь тщательно высушите пластину держателя, чтобы предотвратить шум перекрестных помех и шунтирование сигнала. После высыхания держателя закрутите верхнюю часть и заполните перфузионные каналы перфузионным раствором из шприца с помощью иглы. Поместите держатель образца рядом с теплообменным блоком.

Затем подключите входную и выходную линии перфузии. Завершите настройку, подключив электроды к усилителю ERG и прикрепив блок управления стимулятором к держателю образца. Использование адаптера Для получения больших и многоразовых откликов важно выполнять тщательное рассечение и монтаж сетчатки, а также поддерживать стабильную и безпузырчатую перфузию над сетчаткой перед сбором данных.

Подождите от 10 до 20 минут, чтобы температура и функция сетчатки стабилизировались, реакция вспышки была зарегистрирована от темноты, адаптированной к дикому типу C 57 черным шести сетчаткам с использованием различных стандартных растворов для изобилия. Формы волны отклика и кинетика оказались одинаковыми в средах Эймса и в средах блокировок. Чувствительность палочковых фоторецепторов также была аналогичной.

С другой стороны, в кучах буферизованного раствора рингера без отклика бикарбоната или карбогена амплитуды были значительно меньше. Стабильность BWA также часто нарушалась в кучном звоне. Добавление 40 микромоляров A PB эффективно удаляло положительный зубец B.

Это выявило большую, медленную отрицательную волну, которая была приписана активности клеток Мюллера, добавив 100 микромоляров упраздненного бария. Этот компонент раскрывает фоторецепторный ответ сигнала ex vivo ERG. Этот метод может быть объединен с другими инструментами, такими как фармакология и генетика, чтобы ответить на вопросы о молекулярных механизмах передачи сигналов сетчатки и слепоты у млекопитающих, включая сетчатку человека.