Метод Дистанционно заставить замолчать нейронной активности в течение Грызуны дискретных фаз обучения

Цель этой процедуры — временно и дистанционно подавить нейронную активность в дискретных областях мозга, пока животные заняты задачами обучения и памяти. Это достигается путем предварительной загрузки a a V, содержащего дизайнерский рецептор и репортер, в шприц для инфузии. Второй шаг заключается во введении буквы a V в интересующую область мозга крысы.

Далее готовится биологически инертный конструкторский препарат клозапин и оксид и вводится системно крысе. Последним шагом является проведение поведенческого тестирования с использованием парадигмы сенсорного преобусловливания. В конечном счете, иммунофлуоресцентная микроскопия тканей мозга крысы используется для проверки расположения дизайнерского рецептора.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области поведенческой нейробиологии, включая, помимо прочего, регулирование мотивации, внимания, обучения и памяти Обеспечить соблюдение всех институциональных мер предосторожности для работы с аденоассоциированными вирусами на протяжении всего вируса, используемого в этом видео, классифицируется как соединение первого уровня биобезопасности. Приготовьте 10%-ный раствор отбеливателя. Обеззараживание представляет собой место для отходов, бегу, содержащую раствор отбеливателя, и стерильный шприц объемом 10 микролитров.

На рабочем месте поместите микроцентрифужную трубку, содержащую аликвоту a V, в стандартные настольные тиски Load, шприц объемом 10 микролитров, содержащий не менее четырех микролитров A v. Убедитесь, что в четырех микролитрах раствора A V нет пузырьков воздуха. В шприц выбросьте пустую пробирку с вирусом в стакан, содержащий 10% отбеливателя.

Добавьте еще 10% отбеливателя в контейнер для отходов и дайте отходам постоять 30 минут, прежде чем утилизировать обеззараженные жидкие отходы в соответствии с рекомендациями учреждения. Подготовьте операционную область, положив впитывающую настольную бумагу под стереотаксический аппарат и на прилегающее пространство, предназначенное для работы с вирусами. После индуцирования анестезии было 3% изофа, фтора и кислорода со скоростью один литр в минуту.

Сбрил шерсть от межглаз до чуть задних за уши. После бритья поместите крысу обратно в индукционную камеру на три минуты, зафиксировав крысу в стереотаксическом аппарате. Накройте глаза офтальмологической мазью и подготовьте место разреза путем чистки Бетадином.

После того, как вы сделаете разрез по средней линии площадью 2,4 сантиметра на коже, расположенной над черепом, начиная примерно на два миллиметра от глаз, оттяните кожу, чтобы обнажить череп, а затем очистите мембранную ткань от черепа до тех пор, пока BGMA и лямбда не станут четко видны. Убедившись, что череп плоский, расположите сверло в точке bgma, обнулите координаты, а затем переместите сверло в желаемые медиальные, латеральные и передние задние координаты. Просверлите отверстие с помощью сверла диаметром 0,9, 0,7 или 0,5 миллиметра.

Настройте инфузионный насос на подачу вируса со скоростью 0,2 микролитра в минуту. Вставьте шприц в инфузионный рукав стереотаксического устройства и опустите шприц до нужной координаты. Используйте насос для доставки нужного количества вируса после завершения доставки вирусов.

Оставьте шприц на месте на 10 минут, чтобы предотвратить обратный ток в отслеживаемую иглу, медленно поднимайте шприц со скоростью около пяти миллиметров в минуту. Затем перейдите к следующей координате и повторяйте процедуру до тех пор, пока все координаты не будут заполнены буквой a v. После закрытия раны и оказания послеоперационной анальгезии согласно утвержденному протоколу поместите крысу в чистую клетку с подстилкой, крышкой и надлежащими табличками.

Когда крыса полностью оправится от наркоза, верните ее в помещение для проживания. Подождите три или более недель до начала поведенческого тестирования, чтобы убедиться в адекватной экспрессии дизайнерского рецептора. На этом рисунке показаны три фазы парадигмы сенсорного прекондиционирования: фаза прекондиционирования, фаза обусловливания и фаза тестирования.

Дизайнерский препарат, клозапин и оксид или CNO используется для подавления нейронной активности. Здесь CNO вводится за 30 минут до каждого сеанса предварительного кондиционирования. После приготовления свежего раствора клозапина и оксида в дозе один миллиграмм на миллилитр, согласно инструкции в письменной части протокола, введите КНО внутрибрюшинно в дозе один миллиграмм на килограмм за 30 минут до поведенческого тестирования.

Инициируйте компьютерный код для соответствующего поведенческого сеанса. По прошествии 30 минут поместите крыс в тестовые камеры и начните первую из 4 64-минутных сессий предварительной подготовки, представив крысам 12 смешанных испытаний, которые состоят из доставки слуховых и визуальных стимулов. В шести попытках в течение 10 секунд был представлен сигнал в качестве предпосылочного стимула, за которым немедленно последовало пятисекундное предъявление мигающего светового стимула в остальных шести попытках.

Покажите белый шум, только непроветрившийся стимул в течение 10 секунд. После завершения фазы предварительной подготовки начните сеансы подготовки, которые будут проводиться в течение пяти дней подряд. Предоставьте крысам восемь опытов, которые состоят из доставки визуального стимула, мигающего света в течение пяти секунд, за которым немедленно следует доставка 2 45-миллиграммовых пищевых гранул.

Это время включает в себя интервалы между тренировками, которые составляют семь минут после завершения сеансов подготовки. Проведите одну 78-минутную тестовую сессию, представив крысам 12 смешанных попыток, которые состоят только из доставки слуховых стимулов. На шести судебных процессах.

Предъявите тональный стимул, только стимул предварительного условия в течение 10 секунд. В остальных шести попытках приведите белый шум, непарный стимул в течение 10 секунд. По завершению поведенческого задания немедленно извлеките крыс из камер и верните их в колонию животных.

Проанализируйте данные фазы кондиционирования и тестирования в соответствии с подробными инструкциями в письменной части протокола. После проведения иммуногистохимии, направленной против меченого репортера или репортерного белка, исследуйте срезы окрашивания с помощью микроскопии, чтобы установить расположение и экспрессию дизайнерского рецептора и/или репортера, как ожидалось от контрольной группы, и экспериментальные крысы аналогичным образом узнали о павловской связи между мигающим световым стимулом и пищей. Во время сеансов кондиционирования.

Во время сессий обе группы также были мотивированы на получение пищевого вознаграждения во время тренировки. Напротив, во время критической тестовой сессии экспериментальные крысы не смогли различить предварительно обусловленные и непроветриваемые слуховые стимулы, в то время как контрольные крысы демонстрируют более сильное поведение при использовании чашки с едой в ответ на предъявление предварительного стимула. Таким образом, контрольные, а не экспериментальные крысы показали эффект сенсорного прекондиционирования.

На этом изображении показано гистологическое подтверждение расположения инфузии a v в интересующую область мозга грызуна после ее развития. Этот метод проложил путь исследователям в области нейробиологии к изучению вклада конкретных областей мозга и/или типов клеток в сложное поведение in vivo.