Выделение и распространение циркулирующих опухолевых клеток из мыши рака Модель
9 октября 2015 г.
Было показано, что циркулирующие опухолевые клетки (ЦОК) играют важную роль в метастазировании опухоли. В данной работе описан способ выделения и размножения ЦОК из цельной крови модели метастазирования гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК) сингенной опухоли мыши.
Общая цель данной процедуры заключается в выделении и культивировании циркулирующих опухолевых клеток из цельной крови сингенной мышиной модели опухоли с метастазами гепатоцеллюлярной карциномы. Это достигается путем первоначального центрифугирования цельной крови, взятой у мышей, и выделения лейкоцитарного слоя (buffy coat). Затем эритроциты в лейкоцитарном слое лизируют, после чего циркулирующие опухолевые клетки собирают в виде осадка.
Затем клетки промывают, суспендируют в полной питательной среде и культивируют. Быстрорастущие опухолевые клетки сохраняют жизнеспособность на протяжении многочисленных пассажей, что можно подтвердить с помощью стандартных методов молекулярной диагностики. Значимость выделения циркулирующих опухолевых клеток с помощью нашего метода заключается в создании воспроизводимой модели, которая может быть оптимизирована для потенциального применения в клинической практике.
Процедуру совместно со мной продемонстрирует Мишель Наду, студентка нашего лабораторного отделения. Для начала возьмите цельную кровь из модели опухоли Ciea Kamau с метастазами гепатоцеллюлярной карциномы, как описано в отдельном выпуске JoVE. Центрифугируйте собранную цельную кровь при 1 167 ×g в течение пяти минут при комнатной температуре.
После разделения на слои осторожно удалите верхний слой плазмы и перенесите его в отдельную пробирку объемом 1,5 миллилитра, не содержащую ROGEN, для дальнейших экспериментов, таких как определение внеклеточных нуклеиновых кислот. Затем перенесите слой лейкоцитарного осадка (buffy coat) в отдельную пробирку объемом 1,5 миллилитра, не содержащую ROGEN, для последующего лизиса эритроцитов. Это необходимо для удаления остаточных эритроцитов из слоя лейкоцитарного осадка перед выделением циркулирующих опухолевых клеток.
Начните с приготовления одного литра буфера для лизиса эритроцитов с конечной концентрацией 155 millimolar хлорида аммония и 10 millimolar Трис. Доведите pH раствора до 7.5. Отберите аликвоту объемом примерно от двух до четырех milliliter из исходного одного литра смеси буфера для лизиса эритроцитов.
Затем добавьте один миллилитр буфера для лизиса эритроцитов в пробирку с собранным лейкоцитарным слоем. Перемешайте содержимое пробирки, несколько раз перевернув ее. Затем инкубируйте пробирку в течение пяти минут при комнатной температуре на лабораторном столе.
Затем центрифугируйте полученную смесь в течение пяти минут. При ускорении 1 167 ×g после центрифугирования образуется беловатый осадок. Медленно и осторожно слейте красноватый супернатант в 10% раствор гипохлорита натрия, не задев осадок.
После удаления супернатанта промойте беловатый осадок в 1 mL PBS. Затем снова центрифугируйте клетки для получения осадка и ресуспендируйте их в полной культуральной среде. Перенесите ресуспендированные клетки в чашку для культивирования и инкубируйте их при 37 °C в увлажненном инкубаторе с воздухом и 5% углекислого газа.
Заменяйте питательную среду для культур клеток каждые два-три дня. Через пять-семь дней циркулирующие опухолевые клетки прикрепятся к чашке для культивирования и начнут пролиферировать. Для подтверждения того, что циркулирующие опухолевые клетки гепатоцеллюлярной карциномы были выделены правильно.
Проведите ПЦР для специфического сегмента гена бета-глобина мыши, согласно описанию и валидации Стью. Затем проведите иммуноокрашивание клеток с использованием антител к специфическому маркеру гепатоцитов — белку Cyclic A MP responsive element binding protein three like three, используя стандартные методы. Здесь представлены репрезентативные изображения циркулирующих опухолевых клеток, полученных от двух разных мышей.
В культуре из ортотопической сингенной мышиной модели гепатоцеллюлярной карциномы. Метастатические опухолевые клетки прикрепляются к поверхности планшета и быстро пролиферируют. Их можно поддерживать более 25 пассажей, и они устойчивы к повторным циклам замораживания-оттаивания.
Таким образом, после просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как выделять и культивировать жизнеспособные циркулирующие опухолевые клетки, а также проводить их молекулярную и функциональную характеристику.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье описывается метод выделения и культивирования циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК) из цельной крови сингенной мышиной модели метастазирования гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК). Данная методика направлена на создание воспроизводимой модели для потенциального применения в клинической практике.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Онкология
- Клеточная биология
- Исследование метастазирования
Обзор
- Циркулирующие опухолевые клетки (ЦОК) играют ключевую роль в метастазировании опухолей.
- Изолирование ЦОК может помочь в понимании прогрессирования рака.
- Современные методы изоляции ЦОК могут отличаться недостаточной воспроизводимостью.
- В данном исследовании представлен новый подход с использованием мышиной модели.
Цель исследования
- Для эффективного выделения ЦОК из цельной крови.
- Для размножения ЦОК с целью дальнейших исследований.
- Для создания модели, которая может быть оптимизирована для клинического применения.
Используемые методы
- Центрифугирование цельной крови для выделения лейкоцитарного слоя (buffy coat).
- Лизис эритроцитов для сбора CTC в осадок.
- Промывка и суспендирование клеток в полной питательной среде.
- Культивирование клеток для оценки их жизнеспособности.
Основные результаты
- CTC остаются жизнеспособными на протяжении нескольких пассажей.
- Стандартные методы молекулярной диагностики позволяют подтвердить природу клеток.
- Данный метод обеспечивает воспроизводимую модель для исследований.
- Возможность оптимизации для применения в клинических условиях.
Выводы
- Данный метод выделения эффективен для получения циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК) из моделей гепатоцеллюлярной карциномы.
- Результаты обосновывают необходимость дальнейших исследований метастазирования рака.
- Этот метод может расширить возможности клинического применения при лечении рака.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для индустрии
Выделение и культивирование циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК) из цельной крови позволяет неинвазивно контролировать динамику опухоли и метастатический потенциал в доклинических моделях. Данный подход способствует валидации мишеней, обеспечивая возобновляемый источник жизнеспособных раковых клеток для изучения механизмов заболевания и разработки методов анализа. Этот метод повышает прогностическую достоверность на ранних этапах поиска за счет возможности функциональной характеристики ЦОК в контролируемых условиях культивирования.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишеней
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы с использованием CTC, полученных из сингенной модели метастазирования ГЦК.
- Практическая ценность: обеспечивает воспроизводимую систему для функциональной валидации мишеней и уточнения сигнальных путей.
- Научная ценность: способствует снижению механистических рисков, позволяя проводить молекулярную и функциональную характеристику выделенных CTC.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получать размноженные CTC, подходящие для подготовки валидированных биологических систем для последующего скрининга в ходе анализа.
- Практическая ценность: обеспечивает стандартизацию анализа за счет стабильной жизнеспособности и пролиферации клеток на протяжении нескольких пассажей.
- Научная ценность: позволяет проводить количественные измерения зависимых переменных, таких как скорость пролиферации и экспрессия маркеров, для оценки воздействия соединений.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: обеспечивает релевантность модели заболевания за счет использования CTC, полученных из ортотопической сингенной мышиной модели метастазирования ГЦК.
- Практическая ценность: поддерживает трансляционную непрерывность от этапа открытия до доклинической валидации благодаря возможности расширения культур CTC.
- Научная ценность: облегчает проведение исследований по согласованию биомаркеров с использованием верифицированных маркеров, специфичных для гепатоцеллюлярной карциномы.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум открытий — от ранней валидации мишени до идентификации ведущих соединений — путем предоставления охарактеризованных культур CTC для функциональных анализов.
- Открывающая биология: поддерживает проверку гипотез и снижение биологических рисков посредством молекулярного подтверждения идентичности CTC.
- Скрининг: обеспечивает получение воспроизводимых популяций клеток, готовых к анализу, с количественными показателями роста для скрининга соединений.
- Аналитика: позволяет получать измеримые результаты, такие как адгезия, пролиферация и экспрессия маркеров для сравнительного анализа условий.
- Трансляционные исследования: связывает этап открытий с доклинической работой с помощью линий CTC, сохраняющих специфические характеристики HCC.
- Корпоративное повторное использование: создает многократно используемую платформу клеточного культивирования, применимую в нескольких циклах исследований и кампаниях по тестированию соединений.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышение прогностической достоверности за счет молекулярной и функциональной валидации культивируемых CTC.
- Операционная ценность: стандартизация и воспроизводимость благодаря определенным протоколам выделения и культивирования.
- Стратегическая ценность: оптимизация принятия решений о продолжении или прекращении исследований («go/no-go») за счет снижения механистической неопределенности в моделях метастазирования.
- Влияние на портфель проектов: приоритезация с учетом рисков на основе функциональных данных, полученных из CTC.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с методами культивирования клеток, гематологии и молекулярной биологии.
- Необходим центрифужный комплекс, лизирующие буферы и стерильная инфраструктура для культивирования.
- Требуется стандартизация между исследовательскими группами для обеспечения воспроизводимости выделения лейкоцитарного слоя (buffy coat) и лизиса эритроцитов.
- При применении метода к различным моделям опухолей или видам животных требуются соответствующие адаптации.
- Ограничено необходимостью проведения этапов молекулярной верификации для подтверждения идентичности CTC после выделения.
