Выделение и распространение циркулирующих опухолевых клеток из мыши рака Модель

Общая цель этой процедуры заключается в выделении и размножении циркулирующих опухолевых клеток из цельной крови сингенной модели опухоли мыши с метастазированием гепатоцеллюлярной карциномы. Это достигается путем центрифугирования, сбора цельной крови у мышей и выделения охристой шерсти. Затем эритроциты в охристой оболочке лизируются и циркулирующие опухолевые клетки собираются в гранулу.

Затем клетки промывают, суспензируют в полной питательной среде и размножают в клеточной культуре. Быстро растущие опухолевые клетки остаются жизнеспособными благодаря многочисленным проходам и могут быть проверены с помощью стандартных методов молекулярной диагностики. Важность выделения циркулирующих опухолевых клеток с помощью нашей методики заключается в том, что она обеспечивает воспроизводимую модель, которая может быть оптимизирована для потенциального использования в клинических условиях.

Вместе со мной эту процедуру будет демонстрировать Мишель Наду, студентка бакалавриата из нашей лаборатории «Начать сбор урожая». Цельная кровь из модели опухоли Ciea Kamau с метастазированием гепатоцеллюлярной карциномы, как описано в отдельном J вертикальной центрифуги. Собирают цельную кровь в 1,167 раза G в течение пяти минут при комнатной температуре.

После разделения на слои осторожно удалите верхний слой плазмы и перенесите его в отдельную 1,5-миллилитровую пробирку без рогена для дальнейших экспериментов, таких как обнаружение бесклеточных нуклеиновых кислот. Затем перенесите слой кода Баффи в отдельную 1,5-миллилитровую бесплатную пробирку ROGEN для подготовки к лизису эритроцитов. Это необходимо для удаления остаточных эритроцитов в слое шерсти Баффи до выделения циркулирующих опухолевых клеток.

Начните с приготовления одного литра раствора буфера для лизиса эритроцитов с конечной концентрацией 155 миллимоляров хлорида аммония и 10 миллимоляров трисса. Отрегулируйте pH раствора до 7,5. Возьмите из запаса примерно два-четыре миллилитра аликвоты, один литр буферной смеси для лизиса эритроцитов.

Затем добавьте один миллилитр буфера для лизиса эритроцитов в пробирку, содержащую собранную охристую шерсть. Перемешайте содержимое пробирки, перевернув ее несколько раз. Затем инкубируйте трубку в течение пяти минут при комнатной температуре на скамейке.

Далее центрифугируйте смешанное содержимое в течение пяти минут. При 1, 167 умножении G после центрифугирования получится белесая гранула. Медленно и осторожно выбросьте красноватый супернат в 10% отбеливателя, не нарушая гранулы.

Выбросив надосадочную жидкость, промойте белесую гранулу в одном миллилитре PBS. Затем снова гранулируют клетки и повторно суспендируют их в полной питательной среде. Поместите ресуспендированные клетки в чашку для клеточной культуры и инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия во влажном инкубаторе с воздухом и 5% углекислым газом.

Меняйте среду для культивирования клеток каждые два-три дня. Через пять-семь дней циркулирующие опухолевые клетки прилипают к чашке для клеточной культуры и начинают размножаться. Для того, чтобы убедиться в правильности выделения циркулирующих опухолевых клеток гепатоцеллюлярной карциномы.

Выполните ПЦР для определенного сегмента гена бета-глобина мыши, как описано и подтверждено Стю. Затем иммуноокрашивают клетки антителом, специфичным к гепатоцитарному специфическому маркеру. Циклический МП МП связывает белок три типа три с использованием стандартных методов, показанных здесь, являются репрезентативными изображениями циркулирующих опухолевых клеток от двух отдельных мышей.

В культуре из ортотопической сингенной мышиной модели гепатоцеллюлярной карциномы. Метастазирующие опухолевые клетки прилипают к чашке и быстро размножаются. Они могут быть расширены за пределы 25 проходов и выдерживать повторные циклы замораживания и оттаивания.

Так что после просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как выделять и размножать кольцевые опухолевые клетки, которые жизнеспособны, а также характеризовать их как молекулярно, так и функционально.