Атомно-силовая микроскопия изображений и силовая спектроскопия поддерживаемых липидного бислоя

Общая цель данного эксперимента состоит в том, чтобы получить изображение и исследовать физические свойства разделительных мембран с помощью атомно-силовой микроскопии. Это достигается путем предварительного смешивания дилио, фосфатидилхолина, fgo, миелина и холестерина в соотношении два к двум к одному с образованием фазоразделяющей липидной смеси. Затем поддерживаемые липидные бислои получают путем нанесения липосомной суспензии на поверхность MICA с помощью атомно-силовой микроскопии.

Затем поверхность бислоя сканируется, создавая топографическое изображение, на котором можно измерить структурные особенности, такие как высота. Затем проводится силовая спектроскопия на определенных участках бислоя для изучения физических свойств бислоя, в первую очередь силы прорыва и толщины мембраны. В конечном счете, результаты показывают различия в свойствах между различными липидными фазами на основе FM-изображений и силовых кривых.

Основным преимуществом этой методики перед существующими методами, такими как флуоресцентная микроскопия, является увеличение разрешения и дополнительных свойств, которые ЧМ может зондировать на образце. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биофизики, такие как структура биологических мембран и белков, встроенных в такие мембраны. Кроме того, мы также можем посмотреть на физические свойства мембраны и проследить, как изменения в составе или дополнительные активные вещества мембраны могут изменить эти свойства.

Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, будут испытывать трудности из-за хрупкого характера образца. Это влияет на подготовку образцов, работу с ними, выбор консолей и условия FM-визуализации и спектроскопии Начните с растворения DOPC, спино, миелина и холестерина в хлороформ в желаемых концентрациях. Затем соедините 18,38 микролитров DOPC, 17,1 микролитров сингмиелина и 11,3 микролитров холестерина, чтобы получить раствор с одним миллиграмм общего липида и молярным соотношением два к двум к одному соответственно.

Смешайте раствор с помощью вортекса, высушите смесь с помощью инертного газа, такого как азот, а затем высушите его под вакуумом не менее одного часа. Далее растворите высушенные липиды в 100 микролитрах PBS до концентрации 10 миллиграмм на миллилитр. Перемешайте вихрем энергично в течение примерно одной минуты.

Получить мутную суспензию, содержащую многослойные везикулы. Следите за тем, чтобы на стенках флакона не осталось липидных пленок. Возьмите 10 микролитров мультиламинарной липидной суспензии и добавьте 150 микролитров поддерживаемого липидного бислойного буфера.

Затем смешайте раствор и переложите его в небольшой стеклянный флакон с крышкой объемом два миллилитра и закупорьте его пленкой для обработки ультразвуком. Смесь при комнатной температуре в ванне обрабатывают ультразвуком в течение 10 минут. За это время раствор должен стать прозрачным и дать небольшие уни или везикулы диаметром примерно 50 нанометров.

Вымойте стекла в воде, а затем добавьте этанол, а затем дайте им высохнуть на воздухе. Далее возьмите диски Micah и снимите внешний слой с помощью скотча. Прикрепите диск MICA к покровному листу с помощью капли прозрачного оптически прозрачного клея.

Затем прикрепите пластиковые цилиндры к слюде с помощью вакуумной смазки и убедитесь в отсутствии утечек. Нанесите весь раствор липосом непосредственно на слюду и добавьте еще 140 микролитров поддерживаемого липидного бислойного буфера, чтобы получить объем 300 микролитров. Затем добавьте 0,9 микролитра одного молярного раствора хлорида кальция до конечной концентрации в три миллимоляра кальция, инкубируйте образцы в течение двух минут при 37 градусах Цельсия, а затем в течение не менее 10 минут при 65 градусах Цельсия во время этого этапа, также предварительно нагрейте поддерживаемый липидный бислойный буфер до 65 градусов Цельсия.

При необходимости добавьте буфер, чтобы образец не пересох. Накрытие камеры для образцов крышкой также сохранит образец гидратированным. Затем осторожно промойте образец предварительно подогретым липидным буфером слоями от 10 до 15 раз, чтобы удалить кальций и несросшиеся пузырьки.

Будьте особенно осторожны на этапах стирки, чтобы избежать высыхания бислоя после этапов стирки. Охладите поддерживаемые бислои до комнатной температуры. Перед измерениями на атомно-силовом микроскопе настройте атомно-силовой микроскоп или FM для выполнения визуализации липидных бислоев в растворе.

Используя контактный режим в соответствии со спецификациями производителя, добавьте в образец буфер, чтобы он оставался погруженным в буфер в течение всего эксперимента. Установите образец на столик A FM и убедитесь, что все модули виброизоляции включены. Подождите не менее 15 минут, пока система уравновесится и уменьшит тепловой дрейф.

Далее подойдите к образцу в контактном режиме мягким наконечником FM-кантилевера до момента контакта. Поскольку бислои очень хрупкие, сведите к минимуму заданное значение наконечника A FM во время визуализации в контактном режиме, чтобы свести к минимуму усилие и скорректировать тепловой дрейф при сохранении контакта с образцом. После завершения визуализации обработайте изображения, подогнав каждую строку сканирования к функциям полиномиального выравнивания.

Выполните удаление линий при сканировании, которое теряет контакт с мембраной. Используя запатентованное программное обеспечение производственной компании A FM, откалибруйте консоль, следуя протоколу производителя, чтобы определить правильное преобразование электрического сигнала в измерение силы. После получения изображения области бислоя выберите область размером пять на пять микрон в бислое для выполнения силовой спектроскопии.

Настройте АСМ, чтобы он принимал силовые кривые в сетке 16 на 16 этой области, в результате чего получится 256 силовых кривых на область. Затем установите смещение Z piso на 400 нанометров. Это определяет максимальный диапазон движения z-пьезо и гарантирует, что консоль полностью оттянется от образца между измерениями.

Далее устанавливаем скорость сближения на 800 нанометров в секунду и скорость уборки на 200 нанометров в секунду. Также установите максимальную целевую силу для каждой силовой кривой, в данном случае 12 наноньютонов. После настройки всех параметров получите силовые кривые, нажав кнопку «Выполнить» в программном обеспечении A FM.

Получите не менее 500 силовых кривых для каждого условия, чтобы обеспечить хорошую статистику, постройте гистограмму значений, а затем подогнайте гистограммы к распределению Гаусса, чтобы получить пик и ширину распределения. Из-за липидного состава при использовании этого исследования образуются две основные области мембраны. Существует жидкостная упорядоченная область, состоящая из fing, миелина и холестерина, и жидкая неупорядоченная область, которая в основном состоит из DOPC.

Профиль высоты, полученный с помощью изображения A FM, может предоставить важную информацию о структуре мембраны, глядя на профиль высоты. Толщину бислоя можно измерить, используя наличие дефектов мембраны. Карта высот также может быть использована для измерения разницы в высоте между упорядоченной и неупорядоченной фазами.

Кривые силы, полученные в режиме силовой спектроскопии, используются для измерения силы прорыва путем измерения значения силы на пике кривой силы, как показано здесь. Кроме того, толщина мембраны может быть получена путем вычитания значения расстояния от пика силовой кривой к значению расстояния. Когда кривая силы снова начинает расти, при попытке выполнить эту процедуру, важно помнить о необходимости сохранять раствор для слоев B и постоянно контролировать сборку FM, чтобы скорректировать эффекты теплового дрейфа и накопления D на наконечнике после этой процедуры.

Другие методы, такие как конфокальная флуоресцентная микроскопия, могут быть выполнены, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как динамика мембраны. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как подготовиться к работе с опорой на слои и использовать FM для получения изображений и исследования физических свойств этих бислоев.