Реализация In Vitro Лекарственной устойчивости Анализы: Максимизация потенциала для раскрытия клинически значимых механизмов сопротивления

Общая цель этой процедуры заключается в содействии быстрому доклиническому открытию клинически значимых однонуклеотидных вариантов, которые могут функционально стимулировать устойчивость к различным классам методов лечения. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области онкологии, например, какие генные мутации могут способствовать функциональной резистентности к терапии в клинике, что в конечном итоге может привести к улучшению методов лечения и альтернативных стратегий клинического ведения пациентов с лекарственной устойчивостью. Основное преимущество этого метода заключается в том, что, поскольку мы способствуем возникновению спонтанных мутаций и применяем непредвзятую технологию скрининга у резистентных клонов, существует большая вероятность того, что эти варианты будут стимулировать таргетную терапию рецидивов в клинике.

Демонстрировать процедуру будет очень талантливый исследователь из моей лаборатории для оценки GI 50 для клеточных линий. Подготовьте пробирную пластину путем засеивания ячеек в непрозрачный прозрачный прозрачный цвет. Дно 96 лунок прокладывайте в 100 микролитрах клеточной среды в соответствии с показанной здесь картой.

Аналогичным образом подготовьте контрольную пластину, добавив ячейки в синие лунки и только средние в белые. После инкубации планшетов при температуре 37 градусов Цельсия в течение ночи уравновесьте люминесцентный реагент жизнеспособности клеток до комнатной температуры и аккуратно перемешайте, инвертировав. Для получения однородного раствора добавьте 80 микролитров реагента в лунки контрольной пластины и встряхивайте содержимое в течение 30 минут.

Для индуцирования лизиса клеток. Для регистрации люминесценции используйте люминометр с экспозицией от 0,1 до 1,0 секунды и длиной волны обнаружения 560 нанометров. Затем, чтобы добавить испытуемые соединения в планшеты для анализа, проведите серию разведения соединений в ДМСО один к четырем, начиная с концентрации 2000 микромоляров, что в общей сложности составит 10 разведений.

Затем добавьте последовательно разведенные соединения к среде, чтобы получить смесь сложной среды с конечной концентрацией в 10 раз. Храните составную пластину при температуре минус 20 градусов Цельсия для использования на третий день анализа. Затем добавьте 10 микролитров разведенных соединений в клетки в трех экземплярах так, чтобы максимальная доза составила 10 микромоляров.

Инкубируйте пластины при температуре 37 градусов Цельсия в течение трех дней. На третий день приготовьте смесь среднего состава объемом 400 микролитров One X, используя составные пластины, приготовленные за три дня до этого. Переверните пробирные пластины, чтобы удалить среду, и промокните насухо на автоклавных бумажных полотенцах два-три раза.

Добавьте один х состав в лунку, затененную синим цветом, и добавьте 100 микролитров среднего в лунки по периметру, чтобы предотвратить испарение. На шестой день оцените относительное количество жизнеспособных клеток, сняв показания люминесценции, как показано ранее в видео. Затем рассчитайте значения GI 50 с помощью программного обеспечения, такого как PRISM, используя рассчитанные значения GI 50, настройте клетки для анализа лекарственной устойчивости.

При работе с цитостатическим агентом затравливаются клетки при 30-40% конфлюенции в 150-миллиметровых квадратных чашках для культивирования. При работе с токсичным агентом наблюдайте клетки при 70-80% конфлюенции. После определения исходных концентраций соединений в соответствии с текстовым протоколом обработайте клетки исследуемыми соединениями на наличие высокотоксичных соединений, вызывающих гибель клеток в шестидневном анализе жизнеспособности.

Начните с GI 50 и постепенно увеличивайте концентрацию каждые две-три недели, пока не будет наблюдаться устойчивая резистентность. Чтобы изолировать клоны одиночных клеток, используйте фазово-контрастную микроскопию с 40-кратным увеличением для изучения чашки для культивирования и выявления жизнеспособных кластеров клеток на дне чашки. С помощью ручки отметьте клонов среднего размера и хорошо изолированных от других колоний, чтобы выбрать клонов с помощью пипетки P 200.

Удалите питательную среду из чашки и с помощью одного XPBS смойте все плавающие клетки. С помощью наконечника пипетки поднимите клоны и перенесите в лунки 48-луночного планшета, содержащего 50 микролитров 0,25% трипсина, инкубируйте при 37 градусах Цельсия в течение одной-двух минут. Затем добавьте 200 микролитров свежей среды с вдвое меньшей концентрацией соединения, чтобы обеспечить оптимальное восстановление клеток.

Чтобы изолировать клоны с помощью трехмиллиметровых дисков для клонирования, поместите диски в 10-сантиметровую чашку для культуры тканей, содержащую пять миллилитров 0,25% трипсин ЭДТА на две минуты. Затем отсасывайте среду из чашки, содержащей устойчивые клоны, и накладывайте на клоны трипы и замоченные диски клонирования. Инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение одной-двух минут, в зависимости от того, насколько легко клоны отрываются от пластин.

Затем с помощью стерильных щипцов подхватить диски для клонирования и перенести в 48 луночных планшетов 200 микролитров свежей среды, а концентрацию соединения аккуратно пипетировать вверх и вниз, чтобы выбить клетки из клонирующих дисков и инкубировать при температуре 37 градусов в течение ночи следующего дня, извлечь диски для клонирования, инкубировать клетки, Затем оцените устойчивость к лекарственным препаратам. Согласно текстовому протоколу, как показано здесь, HCT 16 клеток обрабатывают в течение длительного периода цитотоксическими. Соединение номер один приводило к спонтанному появлению устойчивых клонов, которые продолжали расти во время лечения.

Клоны были отобраны с помощью пипетки. На этом рисунке все устойчивые клоны с первого по третий продемонстрировали значительную устойчивость к соединению номер один и его близкому аналогу соединению номер два, в то время как все клоны показали чувствительность к неродственному цитотоксическому соединению. Велкейд. После подтверждения фенотипической резистентности GDNA была выделена и отправлена на анализ полного экзомного секвенирования.

Структурные варианты, которые были рецидивирующими и имели потенциал для функционального воздействия, были подтверждены с помощью независимого инструмента секвенирования, такого как секвенирование по Сэнгеру. Показанный здесь пример несет гетерозиготную миссенс-мутацию, и родительская клеточная линия была впоследствии сконструирована для экспрессии мутировавшей CDNA. В то время как гиперэкспрессия дикого типа CDNA не способствовала развитию лекарственной устойчивости.

Мутантный CD NA значительно придавал фенотипическую устойчивость соединению номер один, подтверждая функциональную роль структурной вариации как драйвера резистентности. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как развить спонтанный резистентный рост для скрининга генов, которые отвечают за лекарственную устойчивость в раковых клетках после его развития. Этот метод позволяет исследователям в области онкологии непредвзято исследовать механизмы лекарственной устойчивости как в раковых клеточных линиях, так и на животных моделях.