Создание клинически значимых

Общая цель данной процедуры заключается в создании клинически значимой модели, позволяющей наблюдать за заживлением раны в естественной микросреде. Это достигается путем первоначального извлечения хрусталика из глаза куриного эмбриона. На втором этапе в передней части хрусталика делается небольшой разрез.

Затем проводится гидроэлюция массы клеток волокон хрусталика. Далее капсула хрусталика с прилегающим эпителием расправляется путем нанесения дополнительных разрезов в передней капсуле. Заключительным этапом является фиксация поврежденной культуры к чашке для культивирования тканей для последующего наблюдения за процессом заживления раны.

В конечном итоге, для демонстрации механизмов заживления ран в модели, максимально точно воспроизводящей условия in vivo, используются таймлапс-микроскопия, конфокальная микроскопия и биохимический анализ. Данный метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области заживления ран, например, о том, каким образом клетки координированно перемещаются для закрытия раны. Таким образом, этот метод дает возможность детально изучить процесс репарации тканей.

Данный метод также может быть применен при изучении заживления ран ABER, в частности, фиброза и рубцевания. Начните с размещения трех чашек Петри диаметром 100 мм в стерильном ламинарном шкафу. Наполовину заполните две чашки Петри трис-декстрозным буфером комнатной температуры, оставив третью пустой.

Затем из инкубатора, установленного на 37.7 °C, извлеките оплодотворенное яйцо белой легхорнской курицы на 15-й день эмбрионального развития и протрите внешнюю сторону скорлупы 70% этанолом для стерилизации. После этого осторожно разбейте яйцо и перенесите его содержимое в пустую чашку Петри диаметром 100 мм. С помощью стандартного пинцета и тонких ножниц проведите декапитацию эмбриона и поместите голову в одну из чашек с декстрозным буфером TST.

В течение 15 минут перенесите голову эмбриона цыпленка на крышку чашки Петри. С помощью высокоточного пинцета зажмите заднюю часть глаза, создав небольшое отверстие. Затем захватите стекловидное тело пинцетом и осторожно вытяните его вращательными движениями.

Стекловидное тело вместе с прикрепленным хрусталиком отделится от глаза. Поместите хрусталик и стекловидное тело в оставшуюся чашку Петри с буфером Tex extras. Оставьте хрусталики в буфере не более чем на 30 минут, прежде чем продолжить препарирование.

Затем с помощью прецизионного пинцета под диссекционным микроскопом переместите хрусталик на новую крышку чашки Петри, осторожно счищая краем пинцета любые клетки цилиарного тела, которые были смещены вместе с хрусталиком. Затем отделите хрусталик от стекловидного тела, пережав место его прикрепления к задней капсуле хрусталика. После отделения перенесите хрусталик в каплю 200 µL трис-декстрозного буфера в 35 мм чашке для культивирования тканей и расположите его передней поверхностью вверх.

Переднюю часть хрусталика легко определить по наличию в ткани плотного кольца, которое отмечает границу между внутренней и экваториальной областями эпителия хрусталика. Используя два высокоточных пинцета, сделайте небольшой разрез длиной примерно 850 microns в центре передней капсулы хрусталика, захватив ткань каждым пинцетом и осторожно потянув в противоположные стороны. Затем возьмите шприц объемом 1 ml с иглой 27.5 gauge и наполните его 300 µL декстрозного буфера TST.

Введите кончик иглы в разрез, сделанный в передней капсуле хрусталика, примерно на половину толщины хрусталика. Затем плавно нажмите на plunger шприца, вводя буфер TST с декстрозой в хрусталик. Масса волокон клеток.

Введите от 50 до 200 µL буфера, чтобы отделить массу волокон клеток от окружающего эпителия и капсулы хрусталика. Никогда не вводите более 300 µL. С помощью высокоточного пинцета удалите отделенную массу волокон клеток из хрусталика через место переднего разреза.

Удаление массы волокон клеток из места их прикрепления к задней капсуле создает высоковоспроизводимую область повреждения на базальной мембране, окруженную поврежденным эпителием. Начиная с капсульного мешка, сделайте пять разрезов в передней части хрусталика, доходя до экватора. Разложите полученные пять лоскутов капсулы хрусталика с прикрепленным эпителием на чашке для культивирования стороной капсулы вниз, а стороной клеток вверх.

Слегка прижмите капсулу к чашке пинцетом в каждой точке звезды, чтобы зафиксировать ее. Это создаст небольшие углубления на пяти крайних кончиках x-расширения и обеспечит устойчивое прикрепление к чашке. Затем удалите трис-декстрозный буфер из 35-миллиметровой чашки и замените его 1,5 миллилитрами предварительно подогретой среды M1 99.

Среда, дополненная 1% L-глутамина и пенициллина-стрептомицина. Накройте чашку крышкой и поместите в инкубатор. Поместите культуральную чашку под диссекционный микроскоп и пронаблюдайте за границей между центральной зоной миграции и исходной зоной прикрепления эпителиальных клеток.

Затем с помощью двух высокоточных пинцетов захватите края обеих сторон демаркационной линии между двумя зонами. Осторожно потяните исходную зону прикрепления вдоль линии, чтобы легко разделить две зоны. Продолжайте разделять две зоны по всему периметру культуры, пока обе области не будут полностью отделены друг от друга.

Изучите две фракции с помощью стандартных молекулярных или биохимических методов анализа. Сразу после удаления массы клеток волокнистого слоя активируется субпопуляция обогащенных мезенхимальными восстановительными клетками, которые мигрируют к краю раны эпителия. Эти клетки быстро перемещаются в свободную от клеток область эндогенной капсулы базальной мембраны — центральную зону миграции, чтобы начать заживление.

Описанная здесь техника подготовки раны идеально подготавливает данную модельную систему для наблюдения за этим процессом с помощью микроскопа или видеокамеры; заживление раны происходит быстро, к первому дню культивирования значительная часть раны закрывается. К третьему дню процесс заживления раны обычно завершается после разделения центральной зоны миграции и зоны первоначального прикрепления. В данной работе были проанализированы молекулярные различия между этими отдельными зонами.

Уровни киназы фокальной адгезии измеряли в двух зонах; было обнаружено, что количество фосфорилированной киназы фокальной адгезии повышено в центральной зоне миграции, специфичной для процесса миграции. После освоения данная методика имитации хирургического лечения катаракты может быть выполнена за три минуты при условии правильного проведения процедуры. Посмотрев это видео, вы должны получить четкое представление о том, как создать модель имитации хирургического лечения катаракты, которая максимально точно воспроизводит заживление раны в естественной микросреде.