Name: Скрининг продуктов питания для 1 класса Интегроны и Джин кассет (Видео) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Узнайте метод скрининга интегронов 1 класса и генных кассет в продуктах питания с помощью ПЦР и секвенирования. Этот подход позволяет выявлять антибиотикорезистентные бактерии в пищевых продуктах.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Благодаря Микаэла зале, Лариса Bispo и Густаво Таварес для технической помощи.

<ol><li>Bush, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tackling+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Tackling antibiotic resistance.</a> Nature Rev. Microbiol. 9, 894-896 (2011).</li>
<li>Davies, J., Davies, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+and+evolution+of+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Mol.+Biol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Origins and evolution of antibiotic resistance.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 74 (3), 417-433 (2010).</li>
<li>Costa, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic+resistance+is+ancient%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Antibiotic resistance is ancient.</a> Nature. 477 (7365), 457-461 (2011).</li>
<li>Gillings, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+consequences+of+antibiotic+use+for+the+resistome%2C+mobilome+and+microbial+pangenome%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evolutionary consequences of antibiotic use for the resistome, mobilome and microbial pangenome.</a> Front. Microbiol. 4, 4(2013).</li>
<li>Gillings, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+class+1+integrons+and+the+rise+of+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The evolution of class 1 integrons and the rise of antibiotic resistance.</a> J. Bacteriol. 190 (14), 5095-5100 (2008).</li>
<li>Brassard, S., Lapointe, J., Roy, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+relative+strength+of+tandem+promoters+for+the+antibiotic-resistance+genes+of+several+integrons%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Diversity and relative strength of tandem promoters for the antibiotic-resistance genes of several integrons.</a> Gene. 142 (1), 49-54 (1994).</li>
<li>Partridge, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definition+of+the+attI1+site+of+class+1+integrons%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol%22%5BJournal%5D)">Definition of the attI1 site of class 1 integrons.</a> Microbiol. 146 (11), 2855-2864 (2000).</li>
<li>Gillings, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrons%3A+Past%2C+Present%2C+and+Future%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Mol.+Biol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Integrons: Past, Present, and Future.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 78 (2), 257-277 (2014).</li>
<li>Partridge, S. R., Tsafnat, G., Coiera, E., Iredell, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+cassettes+and+cassette+arrays+in+mobile+resistance+integrons%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Gene cassettes and cassette arrays in mobile resistance integrons.</a> FEMS Microbiol. Rev. 33 (4), 757-784 (2009).</li>
<li>Gillings, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+the+class+1+integron-integrase+gene+as+a+proxy+for+anthropogenic+pollution%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Using the class 1 integron-integrase gene as a proxy for anthropogenic pollution.</a> ISME J. In press, (2014).</li>
<li>Gaze, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impacts+of+anthropogenic+activity+on+the+ecology+of+class+1+integrons+and+integron-associated+genes+in+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Impacts of anthropogenic activity on the ecology of class 1 integrons and integron-associated genes in the environment.</a> ISME J. 5, 1253-1261 (2011).</li>
<li>Gerzova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+microbiota+composition+and+presence+of+selected+antibiotic+resistance+genes+in+carriage+water+of+ornamental+fish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Characterization of microbiota composition and presence of selected antibiotic resistance genes in carriage water of ornamental fish.</a> PLoS ONE. 9, e103865(2014).</li>
<li>Power, M., Emery, S., Gillings, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Into+the+wild%3A+dissemination+of+antibiotic+resistance+determinants+via+a+species+recovery+program%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Into the wild: dissemination of antibiotic resistance determinants via a species recovery program.</a> PLoS ONE. 8, e63017(2013).</li>
<li>Stokes, H. W., Gillings, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+flow%2C+mobile+genetic+elements+and+the+recruitment+of+antibiotic+resistance+genes+into+Gram-negative+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Gene flow, mobile genetic elements and the recruitment of antibiotic resistance genes into Gram-negative pathogens.</a> FEMS Microbiol. Rev. 35 (5), 790-819 (2011).</li>
<li>Moura, A., Oliveira, C., Henriques, I., Smalla, K., Correia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad+diversity+of+conjugative+plasmids+in+integron-carrying+bacteria+from+wastewater+environments%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Broad diversity of conjugative plasmids in integron-carrying bacteria from wastewater environments.</a> FEMS Microbiol. Lett. 330 (2), 157-164 (2012).</li>
<li>Schlüter, A., Krause, L., Szczepanowski, R., Goesmann, A., Pühler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+diversity+and+composition+of+a+plasmid+metagenome+from+a+wastewater+treatment+plant%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotech%22%5BJournal%5D)">Genetic diversity and composition of a plasmid metagenome from a wastewater treatment plant.</a> J. Biotech. 136 (1-2), 65-76 (2008).</li>
<li>Taylor, N. G. H., Verner-Jeffreys, D. W., Baker-Austin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquatic+systems%3A+maintaining%2C+mixing+and+mobilising+antimicrobial+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22TREE%22%5BJournal%5D)">Aquatic systems: maintaining, mixing and mobilising antimicrobial resistance.</a> TREE. 26 (6), 278-284 (2011).</li>
<li>Stalder, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+qualitative+impact+of+hospital+effluent+on+dissemination+of+the+integron+pool%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Quantitative and qualitative impact of hospital effluent on dissemination of the integron pool.</a> ISME J. 8, 768-777 (2014).</li>
<li>Allen, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Call+of+the+wild%3A+antibiotic+resistance+genes+in+natural+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Call of the wild: antibiotic resistance genes in natural environments.</a> Nature Rev. Microbiol. 8, 251-259 (2010).</li>
<li>Wellington, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+natural+environment+in+the+emergence+of+antibiotic+resistance+in+Gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">The role of the natural environment in the emergence of antibiotic resistance in Gram-negative bacteria.</a> Lancet Infect. Dis. 13 (2), 155-165 (2013).</li>
<li>Gillings, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mobilization+of+a+Tn402-like+class+1+integron+with+a+novel+cassette+array+via+flanking+miniature+inverted-repeat+transposable+element-like+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Env.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mobilization of a Tn402-like class 1 integron with a novel cassette array via flanking miniature inverted-repeat transposable element-like structures.</a> Appl. Env. Microbiol. 75 (18), 6002-6004 (2009).</li>
<li>Graham, D. W., Collignon, P., Davies, J., Larsson, D. J., Snape, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Underappreciated+role+of+regionally+poor+water+quality+on+globally+increasing+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Env.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Underappreciated role of regionally poor water quality on globally increasing antibiotic resistance.</a> Env. Sci. Technol. 48 (20), 11746-11747 (2014).</li>
<li>Perry, J. A., Westman, E. L., Wright, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antibiotic+resistome%3A+what%27s+new%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opinion+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The antibiotic resistome: what's new.</a> Curr. Opinion Microbiol. 21, 45-50 (2014).</li>
<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+chain+reaction%3A+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> J. Vis. Exp. 63, e3998-e3998 (2011).</li>
<li>Gillings, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Extraction+of+PCR-Competent+DNA+from+Recalcitrant+Environmental+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22Env.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid Extraction of PCR-Competent DNA from Recalcitrant Environmental Samples.</a> Env. Microbiol. 1096, 17-23 (2014).</li>
<li>Sajjad, A., Holley, M. P., Labbate, M., Stokes, H., Gillings, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+class+1+integron+with+a+complete+Tn402-like+transposition+module%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Env.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Preclinical class 1 integron with a complete Tn402-like transposition module.</a> Appl. Env. Microbiol. 77 (1), 335-337 (2011).</li>
<li>Wright, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic+resistance+in+the+environment%3A+A+link+to+the+clinic%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opinion+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Antibiotic resistance in the environment: A link to the clinic.</a> Curr. Opinion Microbiol. 13 (5), 589-594 (2010).</li>
<li>Stokes, H., Nesbo, C., Holley, M., Bahl, M., Gillings, M., Boucher, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Class+1+integrons+predating+the+association+with+Tn402.-like+transposition+genes+are+present+in+a+sediment+microbial+community%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Class 1 integrons predating the association with Tn402.-like transposition genes are present in a sediment microbial community.</a> Journal of Bacteriology. 188, 5722-5730 (2006).</li>
<li>Lane, D. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLane%2C+DJ+%22Nucleic+Acid+Techniques+in+Bacterial+Systematics%22">Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics</a>. , John Wiley &Sons, Inc. 115-175 (1991).</li>
<li>Holmes, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombination+activity+of+a+distinctive+integron-gene+cassette+system+associated+with+stutzeri.+populations+in+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Recombination activity of a distinctive integron-gene cassette system associated with stutzeri. populations in soil.</a> Journal of Bacteriology. 185, 918-928 (2003).</li>
</ol>

Авторы не имеют ничего разглашать соответствующую.

Выявление интегронов и связанных с ними генов кассет потенциально важным шагом в прогнозировании возникновения новых патогенных возбудителей, отслеживание пути для патогенов в пищевой цепи человека, а также выявление новых сопротивление и вирулентности детерминанты 8,21,26. Целью данной работы было описать рациональный подход для скрининга образцов для 1 класса интегронов, характеризующие их массивы кассетные и идентификации видов бактерий, в которых они проживают. Критические шаги в протоколе привлекать хоро...

Открытие антибиотиков был одним из величайших научных достижений 20-го века. Тем не менее, использование и злоупотребление антибиотиками привело к быстрой эволюции, устойчивых к антибиотикам бактерий, и они в настоящее время представляют собой серьезную угрозу для общественного здоровья в 21-м веке. Рост бактериальных штаммов, устойчивых к большинству вариантов лечения повышает возможность мы вступаем в эпоху, когда противомикробные препараты уже не эффективны 1,2. Генетический механизм, который придает устойчивость к антибиотику является древняя система, предшествовавшие людей и антибиотиков давление отбора миллионы лет 3. Мобильные генетические элементы, такие как плазмиды, транспозонов, геномных островов, интегративных конъюгативных элементов и интегронов может распространять гены устойчивости к антибиотикам (ARG) как внутри, так и между видами бактерий 4. Из них интегронами сыграли центральную роль в распространении ARG, несмотря наТо, что они полагаются на плазмид и транспозонов для мобилизации и введении в бактериальных геномов 5. Интегроны захватить генные кассеты, используя интегрон-интегразу, а затем выразить кассеты, используя интегрон закодированный промоутер 6,7 (рисунок 1). Интегрон гена кассеты небольшие подвижные элементы, состоящие из отдельных открытых рамок считывания (ORF), чьи продукты могут придают устойчивость к антибиотикам или дезинфицирующих средств 8. Класс 1 интегронами являются интегронами наиболее часто оправился от клинических изолятов 5, где они все вместе, приобретенных более 130 различных генов кассет устойчивость к антибиотикам 9. Распространение класса 1 интегронов в синантропных и патогенных бактерий человека связанный генерирует потоки отходов человека, которые содержат большое количество этих генетических элементов 10. По оценкам 10 19 бактерий, которые содержат класс 1 Интегроны освобождены с помощью сточных вод каждый годп Великобритания 11. Поэтому не удивительно, что класс 1 интегронами придающие антибиотиков сопротивления в настоящее время обнаружены в микробиоты диких птиц, рыб и других 12-14 родной природы. Освобождение Интегроны обратно в окружающую среду представляет собой серьезную угрозу для общественного здоровья, так как приобретение новых кассет генов и сложных перестроек с другими мобильными элементами продолжает возникать, в частности, в очистных сооружениях и других водных 15-18. Природная среда становится плодородной вербовки новых детерминант резистентности и условно-патогенных микроорганизмов 19,20. Новые интегрон содержащих бактерии и новые АРГУМЕНТЫ можете круг обратно в человеческом сообществе через зараженную воду и пищу 21,22. Наблюдение окружающей среды аргументов является ключевой стратегией для понимания и управления устойчивостью к антибиотикам в будущем 23. В частности, внимание должно быть уделено пищевых продуктов, которые едят сырыми илислегка приготовленные, так как они представляют собой наибольшую угрозу для передачи новых мобильных элементов и патогенных микроорганизмов. В этом протоколе, в упрощенном подходе для обнаружения, идентификации и характеризации класса 1 Интегроны и связанные с ними генетические кассеты в пищевых продуктах, изложены (рисунок 2). Использование комбинации культивирование и полимеразной цепной реакции (ПЦР), интегронами можно быстро обнаружить в сложных бактериальных сообществ и отдельных штаммов. Методы определения видов бактерий и конформации и идентичности интегрон связанный генных кассет даны. Этот метод пригоден для широкого круга растений и животных продуктов, и примеры типичных рабочих процессов приведены для каждого из этих типов пищевых продуктов.

<table><tbody><tr><td>GoTaq Colourless Mastermix</td><td>Promega</td><td>M7132</td><td>Используется во всех ПЦР</td></tr><tr><td>РНКаза (рибонуклеаза А из поджелудочной железы крупного рогатого скота)</td> <td>Sigma</td><td>R6513-10MG</td><td>Используется во всех ПЦР</td></tr><tr><td>Фермент рестрикции HinFI</td><td>Promega</td><td>R6201</td><td>Используется для расщепления 16S рДНК ПЦР-продуктов. Фермент поставляется с оптимальным буфером и лестницей BSA</td></tr><tr><td>100 bp GE</td><td>Healthcare</td><td>27400701</td><td>Используется в качестве стандартного размера на всех агарозных гелях</td></tr><tr><td>GelRed DNA краситель</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td>ВНИМАНИЕ: При работе с этим материалом необходимо носить средства индивидуальной защиты</td></tr><tr><td>Guanidinium thiocyanate</td><td>Life Technologies</td><td>AM9422</td><td>ВНИМАНИЕ: При работе с этим материалом необходимо носить средства индивидуальной защиты</td></tr><tr><td>CLS-TC Раствор</td><td>MP Biomedicals</td><td>6540409</td><td>Ресуспензионный раствор, используемый в начале геномной экстракции ДНК</td></tr><tr><td>Lysing Matrix E FastPrep Tubes</td><td>MP Biomedicals</td><td>116914500</td><td>Tube, необходимый для механического разрушения клеточных стенок бактерий. Этот код используется для упаковок по 500 туб, доступны меньшие количества.</td></tr><tr><td>Связывающая матрица</td><td>MP Biomedicals</td><td>116540408</td><td>разведена в соотношении 1:5 с 6 М тиоцианатом гуанидиния и использована в методе экстракции геномной ДНК.</td></tr><tr><td>Машина Fast Prep</td><td>MP Biomedicals</td><td>Количество доступных опций</td><td>MP Biomedicals имеет ряд машин FastPrep, доступных для покупки. Посетите <a href="http://www.mpbio.com" target="_blank">http://www.mpbio.com</a> для получения дополнительной информации</td></tr></tbody></table>

Скрининг продуктов питания для 1 класса Интегроны и Джин кассет

Screening Foodstuffs for Class 1 Integrons and Gene Cassettes

Устойчивость к антибиотикам является одной из самых больших угроз для здоровья в 21веке. Приобретение генов резистентности путем латерального переноса генов является основным фактором в распространении различных механизмов резистентности. Среди элементов ДНК, способствующих латеральному переносу, интегоны класса 1 в значительной степени ответственны за распространение детерминант устойчивости к антибиотикам среди грамотрицательных патогенов. В общей сложности эти интегроны приобрели и распространили более 130 различных генов устойчивости к антибиотикам. В связи с продолжающимся использованием антибиотиков, интегроны класса 1 стали повсеместно использоваться в комменсалах и патогенах человека и его домашних животных. Как следствие, теперь их можно найти во всех потоках жизнедеятельности человека, где они продолжают приобретать новые гены и имеют потенциал возвращаться к человеку через пищевую цепь. В этом протоколе подробно описывается оптимизированный подход к обнаружению интегронов класса 1 и связанных с ними кассет с генами устойчивости в пищевых продуктах с использованием культивирования и ПЦР. Используя этот протокол, исследователи должны иметь возможность: собирать и подготавливать образцы для получения обогащенных культур и проводить скрининг на наличие ингронов класса 1; изолировать одиночные колонии бактерий для идентификации интегрон-положительных изолятов; выявить виды бактерий, которые содержат ингроны класса 1; и охарактеризовать эти интегроны и связанные с ними генные кассеты.

Скрининг смешанных культур и бактериальных изолятов intI1 Набор праймеров HS463a / HS464 ПЦР может быть использован для обнаружения присутствия интегрон-интегразы гена класса 1, intI1 (рис 1). Это набор праймеров хорошо работает для обнаружения intI1 в смешанных культурах, а также используется для скрининга бактериальных колоний найденным распространенных пластин (рис 2). Положительные изоляты должны генерировать одну сильную полосу на 471 п.о...

Этот протокол описывает обнаружение интегронов класса 1 и связанных с ними генных кассет в пищевых продуктах.

Antibiotic resistance is one of the greatest threats to health in the 21st century. Acquisition of resistance genes via lateral gene transfer is a major ...

Общая цель данной процедуры заключается в предоставлении оптимизированного подхода для обнаружения интегранов 1-го класса и связанных с ними генных кассет в пищевых продуктах. Это достигается путем первоначального получения обогащенной бактериальной культуры из выбранного пищевого продукта. Вторым этапом является скрининг культуры на наличие интегранов 1-го класса с помощью ПЦР и выделение единичных колоний из смешанной культуры, положительной по интегранам.После скрининга отдельных колоний на наличие интегразонов подготовьте геномную ДНК из этих колоний для проведения диагностической ПЦР с целью дифференциации бактериальных видов и обнаружения генных кассет. Заключительным этапом является очистка продуктов ПЦР и их отправка на анализ последовательности ДНК. В конечном счете анализ последовательности ДНК используется для характеристики генных кассет внутри интегразона первого класса и идентификации видов, в которых они находятся.Резистентность к антибиотикам является одной из главных проблем медицинского лечения в XXI веке. Одним из способов борьбы с антибиотикорезистентностью является обнаружение и отслеживание генов устойчивости к антибиотикам, перемещающихся от человека в окружающую среду и обратно. В данном протоколе будет показано, как выявлять резистентность к антибиотикам.Гены в пищевых продуктах, которые мы можем употреблять в сыром виде или с минимальной обработкой. Процедуру продемонстрирует Лит Уолдрон, постдок, работающий в моей лаборатории. Продукты, употребляемые в сыром или слегка термически обработанном виде, такие как фрукты, овощи и моллюски, представляют наибольшую опасность для здоровья человека.Здесь будет продемонстрирован только процесс приготовления обогащенных культур из морепродуктов. Пожалуйста, обратитесь к тексту протокола для ознакомления с приготовлением культур из фруктов и овощей. Чтобы приготовить обогащенную культуру из морепродуктов, сначала с помощью стерильного пинцета и щипцов выделите пищеварительный тракт креветок.Поместите препарированный материал в стерильную пробирку объемом 1,5 мл, содержащую 200 µL натрий-фосфатного буфера. Разотрите образец пестиком до получения гомогената и перемешайте на вортексе. Раздайте по 5 мл бульона LB в две стерильные пробирки объемом 5 мл и инокулируйте каждую из них гомогенатом морепродуктов.Перемешивайте обе пробирки в течение ночи при 200 OPM, инкубируя одну пробирку при 25 °C, а другую — при 37 °C на следующий день. Храните культуры при температуре 4 °C до момента, когда потребуется выделить единичные колонии из PCR-положительной смешанной культуры. Сначала проведите десятикратное серийное разведение культуры в натрий-фосфатном буфере, добавив 1 mL смешанной культуры к 9 mL натрий-фосфатного буфера и перемешав смесь на вортексе.Добавьте один миллилитр разведения в следующие девять миллилитров натрий-фосфатного буфера и повторяйте процедуру до достижения десятикратного серийного разведения 10⁻⁸. Высейте 100 µL разведений от 10⁻⁴ до 10⁻⁸ на LB-агар. Инкубируйте чашки в двух повторах в течение ночи при той же температуре, которая использовалась для исходной смешанной культуры, до следующего дня.Отдельные колонии можно отобрать с чашек с последовательным разведением. Перед началом подготовки ДНК убедитесь, что все чашки и пробирки с образцами четко промаркированы. Коснитесь стерильной зубочисткой отдельной колонии, а затем перенесите её в ПЦР-пробирку, содержащую 100 µL стерильной воды.Прокрутите зубочистку между пальцами, чтобы часть клеток попала в воду; используя ту же зубочистку, инокулируйте чашку с LB-агаром, сделав штрих от каждой отобранной колонии. Большое количество колоний можно хранить на маркированных чашках. Если длина каждого штриха составляет около одного сантиметра, немедленно закройте крышку, чтобы снизить риск перекрестного загрязнения образцов.Отберите как можно больше различных типов колоний, используя такие критерии, как размер, форма и цвет колоний. Инкубируйте чашки с LB-средой в течение ночи при той же температуре, которая использовалась для начальной обогащенной культуры. Затем культуры можно хранить при температуре four degrees Celsius до момента подготовки ДНК из бактериальных суспензий.Нагрейте образцы до 99 °C в течение 10 минут в термоциклере, затем центрифугируйте в микроцентрифуге при 14 000 ×g в течение пяти минут при комнатной температуре для осаждения клеточного дебриса, после чего верните образцы на лед. Затем проведите скрининг ДНК с помощью ПЦР с использованием праймеров HS 4 63 A и HS 4 64. Следуя процедурам, описанным в тексте протокола, важно избегать любых потенциальных источников контаминации ДНК при проведении ПЦР для оценки результатов амплификации с помощью электрофореза.Семь µL каждого ПЦР-продукта наносят на 2% агарозный гель, который заливают и подвергают электрофорезу в TBE-буфере, после чего окрашивают гель красителем для ДНК. Визуализируют ДНК с помощью УФ-трансиллюминатора. Изоляты, несущие интегрон первого класса, дают одну интенсивную полосу размером 471 bp. Для данных анализов используют геномную ДНК, выделенную из изолятов с положительным результатом ПЦР. Размораживают геномную ДНК на льду, подвергают кратковременному перемешиванию на вортексе и центрифугируют в режиме pulse spin при 14 000 ×g в течение 20 секунд.Последовательности праймеров и условия ПЦР, использованные для диагностических ПЦР, приведены в таблице 1 в рукописи. Сначала повторите ПЦР для гена интегразы первого класса, чтобы подтвердить наличие у изолята ампликона размером 471 bp. Затем идентифицируйте положительные культуры до уровня вида путем амплификации гена малой субъединицы рибосомной РНК 16S-rDNA.Все бактериальные мишени должны давать ампликон 16 S длиной около 1 450 пар оснований, так как многие из этих положительных культур будут идентичны. Виды бактерий различают путем рестрикционного анализа продукта ПЦР 16 S. Рекомендуется использовать рестрикционный фермент HIF 1, поскольку он обеспечивает хорошее разнообразие для мишеней 16 s и является надежным и недорогим ферментом.Приготовьте в стерильной пробирке рабочую смесь для рестрикции объемом 30 µL и добавьте 20 µL неочищенного продукта 16S PCR. Инкубируйте в водяной бане при 37 °C в течение ночи; на следующий день проверьте результат рестрикции на 2% agarose gel. Отобранные продукты 16S PCR затем очищают с помощью коммерческого набора и отправляют в центр секвенирования для определения последовательности ДНК. Используйте полученную последовательность ДНК для поиска в базе данных NCBI DNA с помощью функции Blast N; идентичность нуклеотидов более 97% обычно считается подтверждением видовой принадлежности.Смешанные культуры антибактериальных изолятов скринируют на наличие гена интегразы первого класса с помощью ПЦР. При использовании праймеров HS 4 63 A и HS 4 64 в положительных колониях образуется интенсивная одиночная полоса размером 471 база пар. Геномная ДНК из чистых изолятов используется для характеристики массивов интеркассет; амплификация массивов кассет из интеграонов TN 4 0 2 с использованием праймеров HS 4 58 и HS 4 59 дает продукты различного размера, зависящего от природы и размера компонентов-кассет в массиве.Для идентификации этих кассет требуется секвенирование ДНК. Интегроны первого экологического класса часто встроены в бактериальные хромосомы. Их консервативные области могут быть амплифицированы с помощью праймеров MG 2 84 и MG 2 85, которые нацелены на проксимальный и наиболее дистальный сайты рекомбинации соответственно. Данная ПЦР также приводит к образованию продуктов различной длины в зависимости от природы и размера кассет, входящих в массив.Однако кассеты в природных массивах вряд ли кодируют устойчивость к антибиотикам. Виды бактерий идентифицируются путем амплификации 16 S-R-D-N-A и скрининга продуктов ПЦР с помощью рестрикции. С помощью HIF один отдельный вид будет создавать характерные паттерны, благодаря чему изоляты одного и того же вида можно легко идентифицировать и подтвердить путем секвенирования ДНК.После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как выделять интеграоны 1-го класса и их кассеты антибиотикорезистентности из повседневных продуктов питания.

screening-foodstuffs-for-class-1-integrons-and-gene-cassettes

Research

JoVE Journal

Environment

Окружающая среда

Быстрый и эффективный способ для интеграции чужеродной ДНК интерес в готовых акцептором штаммов, называемых штаммов посадочной площадки, описан. Метод позволяет на конкретных участках интеграции ДНК кассету в инженерных локус площадку приземления данного штамма, через сопряжение и выражения ΦC31 интегразы.

Сайт-специфическая бактериальная хромосома Инженерно: ΦC31 интегразы опосредованная кассеты бирже (IMCE)

Бактерии производят секретируемых соединений, которые имеют потенциал, чтобы влиять на физиологию их микробных соседей. Здесь мы опишем экран сокультивирования, который позволяет обнаруживать таких химически опосредованных межвидовых взаимодействий, смешивая почвенных микробов с люминесцентными транскрипционных штаммов корреспондент Сенная палочка на твердых средах.

Использование сокультивирования обнаружить химически опосредованной межвидовых взаимодействий

В этой работе представлен метод высокопроизводительного скрининга с использованием универсальной системы генетического скрининга ферментов, которая теоретически может быть применена к более чем 200 ферментам. В данном случае единая система скрининга идентифицирует три различных фермента (липазу, целлюлазу и щелочную фосфатазу) путем простого изменения используемого субстрата (-нитрофенилацетат,-нитрофенил-β-D-целлобиозид и фенилфосфат).

Multi-фермента скрининга с использованием высокой пропускной Генетическая ферментного Screening System

Salmonella spp.Shigella spp. являются общие патогенов, приписываемых понос. Здесь мы описываем платформу высокой пропускной способностью для проверки Salmonella spp. /Shigella spp., с помощью ПЦР в реальном времени в сочетании с гидом культуры.

Высок объём платформы для проверки Salmonella spp. /Shigella spp.

Здесь мы представляем собой протокол для использования уже существующих антибиотикам сопротивление кассета удаления конструкции как основу для принятия удаления мутантов в других штаммов E. coli . Такие перегласовки удаления могут быть мобилизованы и вставлен в соответствующий Локус штамм получателей с помощью P1 бактериофага трансдукции.

Производство гена удалений в Escherichia coli , P1 трансдукция с подакцизных антибиотикорезистентности кассеты

Опосредованное петлей изотермальное усиление (LAMP) является изотермальным тестом на усиление нуклеиновой кислоты (iNAAT), который вызвал широкий интерес в области обнаружения патогенов. Здесь мы представляем мультилабораторно-проверенный протокол Salmonella LAMP как быстрый, надежный и надежный метод скрининга сальмонеллы в пище животных и подтверждения предполагаемой изоляции сальмонеллы от культурной изоляции.

Loop-Опосредованное изотермальное усиление для скрининга сальмонеллы в пище животных и подтверждение сальмонеллы от культурной изоляции

Протокол описывает, как достичь направленных на сайт модификаций в геноме малярийных комаров Anopheles с использованием системы φC31 . Описанные модификации включают как интеграцию, так и обмен трансгенными кассетами в геноме attP-несущих стыковочных линий.

Ориентированная на сайт φC31-опосредованная интеграция и кассетный обмен в переносчиках малярии Anopheles

Кампилобактер является основной причиной бактериального гастроэнтерита пищевого происхождения во всем мире. Несмотря на то, что предприятия принимают меры по снижению распространенности инфекции на своих предприятиях, зараженная продукция постоянно попадает к потребителям. Методика, разработанная за последние двенадцать лет, направлена на устранение ограничений существующих методов выделения и обнаружения Campylobacter spp. из сырого мяса.

Обнаружение и выделение Campylobacter spp. из сырого мяса

Мы описываем простую процедуру однокопийной хромосомной комплементации гена насоса оттока с использованием системы экспрессии на основе mini-Tn7 в сконструированный штамм Acinetobacter baumannii с дефицитом эффлюкса. Этот точный генетический инструмент позволяет контролировать экспрессию генов, что является ключом к характеристике насосов оттока у патогенов с множественной лекарственной устойчивостью.

Характеристика мультилекарственных систем оттока у Acinetobacter baumannii с использованием эффлюкс-дефицитного бактериального штамма и системы экспрессии генов с одной копией

Это исследование устанавливает набор стандартных операционных процедур (СОП) для эффективного скрининга и выделения кишечных бактерий, способных расщеплять С-гликозиды.

Скрининг и выделение кишечных бактерий, расщепляющих С-гликозид

Узнайте метод скрининга интегронов 1 класса и генных кассет в продуктах питания с помощью ПЦР и секвенирования. Этот подход позволяет выявлять антибиотикорезистентные бактерии в пищевых продуктах.

Скрининг продуктов питания для 1 класса Интегроны и Джин кассет

Больше видео