Визуализация miniSOG меткой репарации ДНК белков в сочетании с электронной спектроскопии изображений (ESI)

Общая цель следующего эксперимента заключается в картировании распределения белков репарации ДНК вокруг двухцепочечных разрывов ДНК на наноуровне. Это необходимо для изучения ультраструктуры поврежденного хроматина, подвергающегося репарации, с помощью электронно-спектроскопической визуализации. Данная задача решается путем создания конструкций экспрессии ДНК, кодирующих слитые белки белков ответа на повреждение ДНК с использованием флуоресцентного белка и тега mini SOG.

На втором этапе конструкции вводятся в клетки путем трансфекции, после чего клетки подвергаются воздействию лазерного или гамма-излучения. Затем облученные и фиксированные клетки проходят этапы подготовки к электронной микроскопии, чтобы сделать распределение белка репарации, меченного mini SOG, видимым в электронном микроскопе. Полученная электронная спектроскопическая визуализация обеспечивает детальные изображения, которые позволяют анализировать ультраструктуру хроматина и взаимосвязь специфических белков с фокусами репарации ДНК.

Основным преимуществом данной технологии по сравнению с другими существующими методами, такими как иммунозолотое мечение, является то, что она не зависит от доступности антител и обеспечивает достаточно плотное мечение интересующих структур. Как правило, специалисты, впервые применяющие данный метод, сталкиваются с трудностями, поскольку процесс фотоокисления очень чувствителен к pH, интенсивности света и насыщению кислородом. Визуальная демонстрация этого метода имеет критически важное значение, так как этапы фотоокисления, насыщения кислородом и освещения чувствительны к малейшим изменениям, поэтому для воспроизведения результатов важно наглядно продемонстрировать выполнение данной методики.

Д-р Хильмар Фадден, постдок из моей лаборатории, продемонстрирует вам метод культивирования. Используйте клетки остеосаркомы человека, стабильно экспрессирующие белки репарации, меченные mini SOG и M cherry, как описано в прилагаемом текстовом протоколе. После пересева клеток из чашки диаметром 10 см доведите их до 80% конфлюэнтности.

Затем поместите клетки под флуоресцентный микроскоп и с помощью стерильного алмазного пера обведите небольшую область площадью примерно один квадратный миллиметр, содержащую клетки, в которых ранее были отмечены экспрессирующие эктопические белки; сенсибилизируйте клетки, добавив в раствор herx до достижения конечной концентрации 0,5 мкг/мл, после чего поместите их в инкубатор при 37 °C на 20 минут. Затем проведите лазерное микрооблучение клеток с использованием твердотельного лазера конфокального микроскопа с длиной волны 405 нм для индукции повреждений ДНК; после повреждения ДНК зафиксируйте клетки в темноте, используя один миллилитр 4% параформальдегида в 0,1 M натрий-катехольном буфере при комнатной температуре в течение 30 минут.

Дважды промойте клетки четырьмя миллилитрами 0,1 молярного катехолевого буфера с pH 7,4. Затем обработайте фиксированные клетки двумя миллилитрами раствора, содержащего 50 миллимолярного глицина, пять миллимолярного аминотриазола и 10 миллимолярного цианида калия при pH 7,4, в течение 30 минут. Замените буфер двумя миллилитрами буфера для фотоокисления с pH 7,4, приготовленного согласно описанию в сопроводительном текстовом протоколе.

Затем инкубируйте образец в темноте на льду, продувая раствор кислородом для поддержания его насыщения кислородом. Далее осторожно установите чашку с фиксированными клетками на инвертированный флуоресцентный микроскоп, оснащенный иммерсионным объективом 40 x, и переместите ее в область интереса, обозначенную ранее. Возбудите метку mini SOG синим светом, используя фильтры для зеленого флуоресцентного белка.

Продолжайте освещение даже после полного исчезновения зелечной флуоресценции мини-SOG. Продолжайте до тех пор, пока в канале проходящего света не появится коричневый продукт фотоокисления полимеризованного диаминобензидина. Затем зафиксируйте клетки, добавив 1 mL 2% глутарового альдегида в 0.1 M каталическом буфере с pH 7.4, и выдержите в течение 30 минут.

Затем зафиксируйте клеточные мембраны 0.1–0.5% тетраоксидом осмия в 0.1 M какао-буфере натрия в течение 20 минут при pH 7.4. После фиксации обезводьте клетки путем серии промывок этанолом. Затем инкубируйте клетки в смеси 100% этанола и акриловой смолы в соотношении один к одному на шейкере в течение четырех часов.

Затем извлеките смесь и добавьте в образцы 100% акриловую смолу еще на четыре часа. Чтобы полимеризовать смолу, срежьте крышку промаркированной микроцентрифужной пробирки объемом 2 мл лезвием и смажьте ободок ускорителем отверждения акриловой смолы. Осторожно заполните пробирку примерно на две трети белой смолой LR с помощью пастерной пипетки.

Следите за тем, чтобы смола не вступила в контакт с ускорителем на ободке. Удалите смолу, которая попала в лунки чашки, и переверните чашку, установив её на вертикально стоящую микроцентрифужную пробирку так, чтобы ширина пробирки почти полностью перекрывала стеклянное смотровое окно веса чашки. Подождите одну-две минуты, пока ускоритель не загерметизирует пробирку и покровное стекло.

Затем переверните пробирку так, чтобы смола в ней покрыла клетки. Поместите чашку с пробиркой в печь при 60 °C и подвергайте отверждению в течение 12 часов. После отверждения блока извлеките из печи чашку с прикрепленной к ней заполненной смолой микроцентрифужной пробиркой и отделите микроцентрифужную пробирку от чашки.

Утилизируйте предметное стекло с вогнутым дном и осторожно разрежьте микроцентрифужную пробирку лезвием бритвы, чтобы извлечь блок. С помощью лезвия бритвы обрезьте блок таким образом, чтобы остался только квадратный миллиметр области, содержащий участок, ранее отмеченный алмазным или вольфрамовым пером. Затем закрепите блок в ультрамикротоме и обрезайте его обрезным ножом до достижения слоя клеток.

Затем переключитесь на алмазный нож и сделайте ультратонкие срезы клеток толщиной примерно 50 nanometers. Перенесите срезы на медные сетки с размером ячейки 300 mesh для просвечивающей электронной микроскопии. Затем поместите сетки в углеродный напылитель и нанесите на срезы слой углерода толщиной от 0.2 до 0.4 nanometers для повышения их стабильности под электронным пучком просвечивающего электронного микроскопа.

Поместите решетки в просвечивающий электронный микроскоп, оснащенный энергетическим фильтром. Осмотрите клетки на срезах в режиме обычного просвечивания при низком увеличении и сравните их с ранее полученными флуоресцентными изображениями. После обнаружения ядра с треком повреждения ДНК или фокусами репарации ДНК переключитесь в режим энергетической фильтрации и зарегистрируйте образец с построением карты толщины.

Затем зарегистрируйте изображения после края поглощения для карты фосфора при потере энергии 175 эВ и ширине щели 20 эВ. Также зарегистрируйте изображения до края поглощения при потере энергии 120 эВ с шириной щели 20 эВ для получения карт азота. Зарегистрируйте изображения после края поглощения при 447 эВ с шириной щели 35 эВ и изображения до края поглощения при 358 эВ.

Также при ширине щели 35 электронвольт. Откройте карты соотношения элементов в программе для обработки изображений, например, в этой. Скопируйте карту азота в красный канал, а карту фосфора — в зеленый канал RGB-изображения.

Затем наложите и совместите карты. Экспортируйте составное изображение в формате TIFF, а затем откройте его в программе для обработки изображений, поддерживающей работу со слоями. Далее настройте динамический диапазон каждого канала, перемасштабировав минимальные и максимальные значения изображения в восьмибитный набор данных.

Затем в окне слоев вычтите содержание фосфора из карты азота. Преобразуйте изображение в индексированные цвета и создайте желтую таблицу поиска в цветовом пространстве CMYK для карты, отображающей распределение нуклеиновых кислот, и голубую таблицу поиска для отображения карты нехроматиновых белков. Затем создайте новое изображение и импортируйте карты распределения фосфора и нехроматиновых белков в виде разных слоев.

Используйте режим прозрачности экрана, чтобы увидеть оба слоя, наложенных друг на друга. Здесь представлены карты электронного спектроскопического отношения изнутри клеточного ядра, демонстрирующие расположение фосфора и азота при наложении двух карт отношения друг на друга в цветовом пространстве RGB. В результате данной обработки получается изображение, подобное представленному здесь.

Желтые структуры представляют ядерные белки, отражая присутствие как фосфора, так и азота. В данном случае электронная спектроскопическая визуализация используется для наблюдения за изменениями структуры фокусов после гамма-облучения клеток U2 OS. В верхнем ряду представлены изображения необлученных клеток со стабильной экспрессией белков репарации, меченных M cherry.

На второй строке показаны клетки, фиксированные через три часа после облучения. На третьей строке показаны клетки, фиксированные через шесть часов после облучения. Электронная спектроскопическая визуализация показывает, что структура фокусов со временем реорганизуется: относительное количество белка 53 BP1 в фокусе (о чем свидетельствует усиление сигнала азота), по всей видимости, увеличивается, в то время как хроматин (о чем свидетельствует сигнал фосфора) занимает более периферическое положение.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как подготовить облученные клетки, экспрессирующие белки репарации mini so, для анализа ультраструктуры хроматина в фокусах репарации ДНК с помощью электронно-спектроскопической визуализации. Не забывайте, что работа с буфером на основе какао-сульфата натрия, цианидом калия и оксидом осмия может быть крайне опасной, поэтому при выполнении данной процедуры следует всегда соблюдать меры предосторожности, такие как работа в вытяжном шкафу и использование перчаток.