Генерация масштабируемой, металлик высоких-Aspect Ratio нанокомпозитов в биологическом жидкой среде

Общая цель данной процедуры заключается в получении линейных микро- и нанокомпозитов с высоким аспектом с использованием цистеина и исходных материалов, содержащих медь. Это достигается путем предварительного смешивания соницированных наночастиц меди или сульфата меди с цистином и водой в стерильной вентилируемой культуральной колбе. Вторым этапом синтеза является помещение колбы с объединенными компонентами в инкубатор с 5% CO2 при 37 °C минимум на шесть часов.

Затем колбу осматривают визуально и с помощью световой микроскопии. Для определения степени формирования линейных структур на заключительном этапе синтез прекращают, поместив колбу с реакционной смесью в холодильник при температуре four degrees Celsius. В итоге для характеристики синтезированных структур используют цифровую микроскопию. Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими способами, такими как электродепонирование, является то, что описываемый синтез в жидкой фазе легко масштабируется, а сам процесс протекает в физиологических условиях.

Значение данного метода распространяется на терапию и диагностику таких заболеваний, как рак, поскольку синтезированные структуры могут разрушаться клетками, что потенциально обеспечивает способ доставки лекарственных препаратов. Идея этого метода возникла у меня в ходе проведения экспериментов по исследованию потенциальной токсичности различных наноматериалов. Визуальная демонстрация данного метода имеет решающее значение, так как финальные этапы синтеза могут быть сложными для освоения.

Неправильное выполнение процедур может привести к образованию агрегированных структур или к их полному отсутствию. Чтобы осуществить самосборный синтез с использованием наночастиц меди или CMP, приготовьте раствор наночастиц меди, отвесив не менее двух миллиграммов CMP. На этом этапе используйте одноразовые перчатки, чтобы предотвратить возможный контакт CMP с кожей.

Поместите наночастицы в пустой стерильный стеклянный флакон объемом 16 мл к флакону, содержащему CMP. Добавьте стерильную деионизированную воду в соответствующем объеме, чтобы получить раствор с концентрацией 2 mg/mL, и перемешайте раствор на вортексе в течение 20 секунд для диспергирования наночастиц перед началом синтеза. Не заполняйте флакон водой более чем наполовину, так как это будет препятствовать процессу.

При перемешивании с помощью вортекса CMP быстро оседают на дно флакона, и раствор приобретает темный цвет. Перед началом синтеза подвергните раствор CNP воздействию ультразвука в течение 17 минут при комнатной температуре для обеспечения максимальной дисперсии CMP. Периодически проверяйте, происходит ли перемешивание CMP под действием ультразвука; после успешной соникации CMP остаются взвешенными в растворе в течение как минимум 30 минут, при этом раствор сохраняет темный цвет.

Взвесьте 7,29 мг цистина для синтеза. Поскольку цистин не растворим в воде напрямую, перенесите взвешенный цистин в антистатический сосуд для взвешивания, содержащий цистеин. Добавьте достаточный объем стерильного 1 M раствора гидроксида натрия до полного растворения цистина, чтобы получить раствор с концентрацией 72,9 мг/мл.

Полностью растворите цистеин в 100 µL 1 M гидроксида натрия. Затем смешайте 7 µL полученного раствора цистеина с 6 643 µL стерильной воды в стерильной колбе для синтеза. Поместите колбу со смешанным раствором в инкубатор на 30 минут при 37 °C, оставив крышку колбы приоткрытой для обеспечения эффективного перемешивания.

Это будет рабочий раствор цистеина. Ресуспендируйте раствор CNP с концентрацией 2 mg/mL путем вортексирования в течение 30 секунд, так как после этапа соникации CMP осядут; общий объем синтеза составляет 7 mL. Перенесите рабочий раствор цистеина в культуральный флакон площадью 25 cm² и добавьте 350 µL ресуспендированных CMP.

Закройте колбу крышкой и плотно закрутите ее. После объединения всех компонентов для синтеза осторожно перемешайте содержимое колбы, сделав четыре-пять круговых движений. Поместите колбу в инкубатор с углекислым газом и приоткройте крышку, чтобы обеспечить газообмен между содержимым колбы и окружающей средой.

В процессе синтеза выдержите смесь в инкубаторе примерно 24 часа. В ходе синтеза с помощью микроскопии и визуально можно наблюдать формирование высоколинейных композитов. Этот этап является критически важным для подтверждения того, что структуры формируются и что процесс самосборки не затягивается.

Прекратите синтез биокомпозитов после появления в колбе линейных структур, плотно закрыв ее пробкой; промаркируйте колбу, указав условия синтеза, включая дату проведения синтеза и инкубации, а также время синтеза до его завершения. Затем поместите сосуд в холодильник, так как образовавшиеся структуры остаются стабильными в данной форме в течение как минимум одного года. В качестве альтернативы, для проведения синтеза путем самосборки с использованием сульфата меди, замените CMP солью сульфата меди, используя стерильную технику; растворите не менее 2 mg сульфата меди в достаточном объеме стерильной деионизированной воды для получения раствора с концентрацией 2 mg/mL.

Кристаллы сульфата меди легко растворяются при данной концентрации, однако при необходимости перемешайте содержимое пробирки на вортексе и визуально убедитесь, что после приготовления раствора сульфата меди все кристаллы растворились. Проведите синтез, как было продемонстрировано ранее, заменив CMP на сульфат меди. Охарактеризуйте биокомпозиты, полученные из CMP и из сульфата меди, с помощью микроскопии в белом свете и электронной микроскопии для анализа и контроля характеристик биокомпозитов.

Для проведения парасинтеза с помощью световой микроскопии используется инвертированный микроскоп. Композиты оседают на нижнюю поверхность колбы в течение нескольких минут после того, как колбу положат горизонтально, после чего их можно будет сфокусировать. Используйте режим светлого поля микроскопа, чтобы максимально увеличить контраст между биокомпозитами и жидкой средой; композиты, полученные из CMP и сульфата меди, будут иметь цвет от прозрачного до матового, в то время как непрореагировавшие агрегаты CNP будут выглядеть очень темными.

Используйте инвертированную микроскопию в светлом поле для оценки эффективности синтеза в конкретном эксперименте. Например, зафиксируйте наличие или отсутствие не вступивших в реакцию CMP в синтезе. Используйте колбы, в которых получались биокомпозиты на основе CNP, из колб с различными параметрами, такими как время инкубации или продолжительность соникации.

Отдельные CMP слишком малы для наблюдения под световым микроскопом, однако нереактивные агрегаты CNP будут выглядеть как темные объекты округлой формы. Это контрастирует с успешно синтезированными композитами CNP, которые будут иметь высокий аспектный коэффициент, линейную форму и различную длину. Избегайте слишком длительного синтеза до момента его прекращения, так как это приведет к образованию сильно разветвленных структур ежеподобного типа, которые после формирования трудно диспергировать в отдельные структуры.

Также используйте инвертированную микроскопию в белом свете для оценки эффективности синтеза в конкретном эксперименте с использованием сульфата меди. Поскольку при использовании данного протокола сульфат меди полностью переходит в раствор, этот раствор будет выглядеть менее темным, чем раствор, полученный в результате синтеза с использованием CMPs.

Задокументируйте размер и степень охвата композитов сульфата меди, сравнив колбы с различными условиями синтеза, такими как продолжительность синтеза до его завершения. Чтобы сначала сконцентрировать биокомпозиты после синтеза, добавьте 6 мл структур, полученных из CNP, или структур, полученных из сульфата меди, в центрифужную пробирку объемом 15 мл. Центрифугируйте в течение 10 минут при 500 ×g и комнатной температуре для получения осадка при малых объемах.

Добавьте 500 µL структур в растворе в пробирки объемом 0,6 мл, центрифугируйте при 2000 ×g и комнатной температуре в течение не менее 10 минут до образования осадка. Перенесите структуры в стерильную деионизированную воду и подвергните ультразвуковой обработке в течение не менее 10 минут для ресуспендирования. При многократном повторении данного процесса структуры фрагментируются, и их средняя длина уменьшается.

Изменения размеров композитов при различном времени соникации документировали с помощью инвертированного светового микроскопа и цифровой камеры; наши репрезентативные результаты по изучению биокомпозитов в культуральной среде в течение 82 часов показали, что первоначально равномерные дисперсии CMP агрегируют в микроструктуры. Со временем количество отдельных частиц уменьшается и формируются более крупные агрегаты. В конечном итоге появляются крупные агрегаты с линейными структурами, образующие структуры ежеобразного типа.

Показан процесс превращения CMP в линейные биокомпозиты. CMP объединяли с цистеином и водой, исходя из первоначально равномерных дисперсий CMP. Через три часа образуются микроструктуры из агрегатов, к шести часам формируются промежуточные структуры.

Структуры с высоким аспектом формируются при электронной микроскопии. Характеристика синтезированных биокомпозитов представлена методом просвечивающей электронной микроскопии, которая демонстрирует исходный материал CNP с формирующимися линейными композитами; исходные CMP имеют округлую форму, что показано методом сканирующей электронной микроскопии или SEM. Нано- и микроструктурные особенности композитов, сформированных из CMP и цистеина, показаны с помощью SEM.

Характеристики композитов, образованных из сульфата меди и цистеина, также представлены с помощью СЭМ с энергодисперсионной рентгеновской спектроскопией. Показан элементный анализ исходных материалов и синтезированных линейных компонентов. В исходных CMP наблюдается выраженный пик меди при отсутствии серы.

Биокомпозиты из CMP и цистина демонстрируют появление пиков серы и углерода из-за использования цистина в качестве исходного материала с сульфатом меди. В материале наблюдаются пики меди и серы. Биокомпозиты из сульфата меди и цистина показывают появление пиков углерода из-за цистина. При должном освоении данной методику можно выполнить за 12–24 часа при условии правильного проведения процедуры.

При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости контролировать ход синтеза как визуально, так и с помощью микроскопа, чтобы синтезированные структуры не подверглись чрезмерной агрегации. После завершения этой процедуры можно применить другие методы, такие как флуоресцентное мечение структур, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, связываются ли синтезированные структуры с клетками. После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как подготавливать реагенты для синтеза, правильно смешивать их, контролировать процесс синтеза, а также концентрировать и модифицировать структуры после завершения синтеза.