Высокодоходные и экономически эффективной системы Выражение человека Гранзимы в клетках млекопитающих

Общая цель этой процедуры заключается в получении высоких выходов фолиевых гликозилированных и ферментативно активных гранзимов в эмбриональных почках человека 2 93 Т-клеток. Это достигается путем предварительной экспансии HEC 2 93 Т-клеток в соответствующих чашках для культуры тканей. Обычный размер заготовки после разваривания состоит из 20-25 блюд для культуры.

Вторым шагом является временная трансфекция расширенных клеток плазмидой экспрессии гранзима с использованием эффективного метода фосфата кальция. Затем клеточный супернат собирают, а секретируемые большие ферменты очищают с помощью иммобилизованной металлоаффинной хроматографии. Заключительными этапами являются активация больших ферментов путем лечения киназой и дальнейшая очистка протеаз с помощью катионообменной хроматографии.

В конечном счете, ферментативная активность проверяется с помощью быстрого и надежного холометрического анализа, поскольку наличие активной протеазы в достаточных количествах является ограничивающим фактором в исследованиях гранзима. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в этой области, такие как характеристика новых путей гибели клеток в различных организмах или идентификация новых субстратов протеаз в подходах к экспрессии больших ферментов. Сначала вырастите HEC 2 93 Т-клетки в 20 мл питательной среды, используя чашки для культуры тканей размером 150 на 25 мм. Клетки свободно прикрепляются при 80% Co Fluency, но могут быть механически отделены без трипсина путем тщательного пипетирования вверх и вниз планшета.

Клетки в ночь перед трансфекцией дают от 60 до 70% плавности в день трансфекции. Обычный размер заготовки состоит из 20-25 блюд из культуры. За час до трансфекции изменил стандартную культуральную среду до 20 миллилитров трансфекционной среды ближе к концу часовой стадии инкубации, смешал 400 мкг плазменной ДНК с 10,95 мл двойной дистиллированной воды и 1,55 мл двух моляров хлорида кальция в 50-млилитровых пробирках за одну-две минуты до трансфекции.

При 12,5 мл двух х куч буферизуют физиологический раствор до 12,5 мл раствора кальция ДНК, смешивают путем инверсии пробирок перед инкубацией в течение 30 секунд. При комнатной температуре добавьте эту смесь, по каплям прямо в ячейки по пять миллилитров на блюдо, равномерно рассыпьте по всей площади, доведя среду до слегка оранжевого цвета. Инкубируйте чашки для культивирования в течение 7-11 часов в инкубаторе для культуры тканей.

После инкубации виден мелкий осадок. Удалите трансфекционную среду. Тщательно промойте подогретым PBS и добавьте 20 миллилитров питательной среды, свободной от сыворотки, перед инкубацией в течение 72 часов в инкубаторе для тканевых культур, проанализируйте трансфекцию и эффективность экспрессии, запустив образец клеточного надосадочной жидкости на странице SDS и окрашивая кумаси.

Блестящий синий. Чтобы визуализировать гранзим бандаж. После инкубации надосадочную жидкость клеточной культуры декантируют в пробирки объемом 250 миллилитров и очищают центрифугированием.

Проведите первый спин, который очистит среду от оторвавшихся ячеек. Перелейте надосадочную жидкость в свежие 250 миллилитровые пробирки и вращайте при давлении 4000 G в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия, чтобы удалить оставшийся клеточный мусор. Далее добавьте пять миллилитров хлорида натрия, 6,25 миллилитров трисового основания и один миллилитр сульфата никеля плюс 250 миллилитров очищенной надосадочной жидкости.

Отфильтруйте надосадочную жидкость с помощью вакуумной фильтрующей установки объемом 500 миллилитров. Уравновесьте иммобилизованную никелью аффинную хроматографическую колонку с его связывающим буфером. A с использованием подходящей системы FPLC.

Затем нанесите очищенную надосадочную жидкость на уравновешенную колонку со скоростью потока 0,5 миллилитров в минуту при четырех градусах Цельсия. После нанесения надосадочной жидкости промойте колонку его связующим буфером до тех пор, пока не будет достигнут базовый уровень поглощения ультрафиолета или ультрафиолета. Разбавляйте гранзимы линейным градиентом ILE 20 миллилитров со скоростью потока 0,5 миллилитра в минуту, собирая при этом две миллилитровые фракции.

Проанализируйте элуцианские дроби по странице SDS и окрашиванию кумаси. Вытяните гранд зим, содержащий фракции, в ошеломляющую пробирку. Храните небольшой образец при температуре минус 20 градусов Цельсия в качестве предварительного контроля энтерокиназы.

Добавить энтерокиназу в дозе 0,02 ЕД на 50 мл исходной надосадочной жидкости непосредственно в объединенную фракцию в диализной трубке и проводить диализ в течение ночи при комнатной температуре в энтерокиназном буфере. На следующий день анализируйте обработанную киназу гранд в сравнении с контролем киназы до входа с помощью страницы SDS и окрашиванием в синий цвет. Когда обработка терминала завершена.

Замените диализный буфер на S-буфер A и диализируйте еще четыре часа при комнатной температуре, прежде чем отфильтровать DIALATE eight. Затем уравновесьте столбец S буфером S. А. Загрузите образец в колонку со скоростью потока 0,5 миллилитров в минуту при температуре четыре градуса Цельсия после загрузки образца.

Промойте колонку с S-буфером A до тех пор, пока не будет достигнут базовый уровень поглощения ультрафиолета. Разбавьте гранзимы 30 миллилитровым линейным градиентом хлорида натрия: гранзим А элюирует при приблизительно 650 миллимолярах хлорида натрия, гранзим В - при приблизительно 700 миллимолярных хлоридах натрия и гранзим М - при приблизительно 750 миллимоларах хлорида натрия. Соберите фракции, содержащие гранзимы, и сконцентрируйте примерно до 100 микромоляров в спин-фильтрах, добавьте концентрированные препараты гранзима и храните при температуре минус 80 градусов Цельсия.

Затем проанализируйте элуцианские фракции с помощью SDS page и chole metric анализов для выполнения chole metric анализы распределите небольшие образцы гранзима из эллюцианских фракций или концентрированных запасов в 96. Хорошо плоские днищевые плиты включают в себя положительный контроль и отрицательный контроль. Добавьте в каждый по 100 микролитров пробирного буфера.

Хорошо инкубируйте тарелку в течение 10 минут при температуре 37 градусов по Цельсию. Наконец, измерьте оптическую плотность на 405 нанометрах в считывателе микропланшетов. Этот протокол позволит получить высокие выходы чистых гранзимов, как показано на этом репрезентативном геле с окрашиванием SDS на странице Кумаси, показывающем гранзим BE из колонки S.

Рекомбинантные гранзимы проявляют такую же активность, как и нативные препараты протеазы, как показано в этом цветовом метрическом анализе, сравнивающем активность рекомбинантного и нативного гранзима В. Важно отметить, что лечение эндо Н указывает на то, что гранзимы, вырабатываемые в HEC 2 93 Т-клетках, полностью гликозилированы. Рекомбинантные большие ферменты способны расщеплять высокомолекулярные белковые субстраты, как показано в этом репрезентативном анализе гранзима с использованием бактериального белкового субстрата и UOCD.

Здесь полоса, представляющая собой расщепленный N-O-U-C-D, медленно исчезает с увеличением концентрации гранзима. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как производить полностью гликозилированные и проактивные большие ферменты с высоким выходом в HK 2 93 Т-клетках.