Иммуногистохимический Визуализация гиппокампа активности нейронов После пространственного обучения в мышиной модели нарушениями развития нервной

Общая цель данного эксперимента состоит в том, чтобы обнаружить изменения в фосфорилировании гиппокампа после пространственного обучения у двух нокаутированных мышей Grailed в качестве модели нарушений развития нервной системы. Это достигается путем сперва тестирования как дикого типа, так и в граале двух нокаутирующих мышей в водном лабиринте Морриса. В качестве второго шага мозг мышей удаляют и готовят срезы мышей дикого типа и нокаута путем нарезки viome.

Затем срезы мозга мышей дикого типа и нокаута обрабатываются для иммуногистохимии и используются для обнаружения изменений фосфорилирования в гиппокампе. Полученные результаты показывают различия в фосфорилировании РЦ гиппокампа между диким типом и мышами с двумя нокаутами Грааля на основе визуализации иммуногистохимического окрашивания с помощью световой микроскопии. Этот метод позволяет идентифицировать определенные подмножества нейронов гиппокампа, которые активируются после выполнения специальной задачи обучения, зависящей от гиппокампа, такой как водный лабиринт Мориса.

Впервые мы добавили идею этого метода, когда решили исследовать молекулярный каскад, который подчеркивает молекулярный дефицит у мышей с нокаутом второй степени, мышиной модели расстройств аутистического спектра. Для начала обучите мышей из различных слоев общества, представляющих интерес к задаче пространственного обучения, такой как Моррис Уотер Мэй. Следуйте режиму тренировок, описанному в сопроводительном текстовом протоколе, в конце периода обучения усыпьте мышей, а затем исправьте и удалите их мозг.

Когда вы будете готовы продолжить процедуру, удалите мозжечок с помощью скальпеля. Затем приклейте остальную часть мозга вертикально к держателю вибрато. Разрежьте мозг на последовательные срезы толщиной от 20 до 40 микрон по всему дорсальному гиппокампу.

Переложите каждый срез в одну лунку 24-луночной пластины, заполненной одним миллилитром 0,1 молярного PBS, перенесите от трех до пяти дорсальных участков гиппокампа для каждой мыши в лунки 24-луночной пластины, содержащей 500 микролитров 0,1 молярного PBS для каждого. Хорошо промойте срезы, содержащиеся в каждой лунке, 500 микролитрами 0,1 моляра PBS, выполняйте все промывки и инкубации при комнатной температуре с бережным перемешиванием, если не указано иное. Под вытяжным шкафом инкубируйте срезы в 40% метаноле, 1% перекиси водорода в 0,1 моляре PBS в течение 20 минут, чтобы погасить активность эндогенной пероксидазы.

После еще трех промывок в 0,1 молярного PBS пронзайте секции, инкубируя их в 500 микролитрах 0,2% Triton X 100 в течение пяти минут, пока секции инкубируются, подготовьте достаточное количество блокирующего буфера для всего эксперимента. Затем удалите проницаемый раствор и добавьте в каждый по 100 микролитров блокирующего буфера. Хорошо инкубируйте секции в течение одного часа.

Далее удалите блокирующий буфер и покройте участки фосфорилированной внеклеточной регулируемой киназой. Первичное антитело разводят один к 500 в блокирующем буфере. Инкубируйте срезы в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия с легким перемешиванием на следующий день после трех промывки срезов в 0,1 моляра PBS в течение пяти минут.

Каждый инкубировал секции с конъюгированным с биотином вторичным антителом, разведенным от одного до 250 в блокирующем буфере в течение одного часа при комнатной температуре во время инкубации. Приготовьте реагент A BC не менее чем за 30 минут до использования, чтобы дать достаточно времени для образования комплекса Адена и биотина. Промыв срезы еще три раза 0,1 молярного PBS, добавьте реактив A, b, C и дайте ему инкубироваться вместе с образцом в течение 45 минут.

Во время следующей серии из трех стирок в PBS приготовьте рабочий раствор DAB в вытяжном шкафу в соответствии со спецификациями производителя, аликвотируйте рабочий раствор DAB в пластине. Затем перенесите секции в лунки, содержащие рабочий раствор DAB, и медленно поворачивайте пластину, чтобы обеспечить максимальное воздействие раствора на секции. Следите за реакцией DAB на микроскопе до тех пор, пока не разовьется достаточный сигнал.

Примерно через две-пять минут остановите реакцию при желаемой интенсивности цвета, промыв ткань в 0,1 моляра PBS. После еще трех стирок в PBS установите секции на предметные стекла с желатиновым покрытием и высушите их при комнатной температуре не менее трех-четырех часов. После сушки на воздухе перенесите горки в вытяжной шкаф и обезвожьте секции, последовательно поместив их интегрированные растворы этанола на две минуты каждая, затем очистите слайды от 100% ксилола в течение пяти минут.

Накройте их, сдвиньте предметные стекла с помощью монтажного носителя и оставьте их в вытяжном шкафу на ночь для высыхания, перенесите предметные стекла в светлопольный микроскоп, оснащенный камерой и объективом с 20-кратным увеличением. Получите несколько изображений светлого поля с каждого участка с 200-кратным увеличением, охватывающим изображение спинного гиппокампа. От трех до пяти секций от каждого животного.

Здесь показаны срезы из дорсальных областей hippo campi мыши дикого типа и мыши Grailed с двумя нокаутами, окрашенные на фосфорилирование. Внеклеточный регулирует надежное молекулярное считывание зависимой от обучения активации нейронов. Обе эти мыши перед жертвоприношением прошли классический режим пространственного обучения, зависящий от гиппокампа, водный лабиринт Морриса.

В последний день испытаний две нокаутированные мыши Grailed продемонстрировали значительный дефицит пространственного обучения по сравнению с мышами дикого типа. Для анализа срезов мозга мышей было подсчитано общее количество положительных клеток в различных областях гиппокампа. В слое с тремя параметрами CA у мышей дикого типа было значительно больше фосфорилированных RK-положительных клеток на область, чем у мышей с нокаутом.

Противоположные результаты были обнаружены в слое хили и гранулярных клеток или GCL. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как исследовать состав фоса на срезах мозга из гиппокампа как генетических, так и фармакологических мышиных моделей нарушений развития нервной системы, характеризующихся когнитивным дефицитом. Этот метод также может быть использован для изучения изменений формулировки раздражающей силы в других областях мозга, а также для выполнения когнитивных поведенческих задач, отличных от лабиринта Мориса Уотера.

Не забывайте, что работа с бензином DIA может быть чрезвычайно дезертирской, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение соответствующих средств защиты.