Легким и эффективным Подготовка Tri-компонентов флуоресцентных гликополимеров помощью плот контролируется полимеризации

Общей целью этой процедуры является хорошо контролируемый синтез флуоресцентных статистических линейных гликополимеров с использованием обратимой фрагментации добавления, переноса цепи или полимеризации на основе рафта. Это достигается путем предварительного синтеза гликомономера двух лактобиоэтилметаминовых акриламидов, или L-A-E-M-A. Второй шаг заключается в использовании рафтовой полимеризации L-A-E-M-A-N двух аминоэтилметаминовых акриламидов, или A EMA и N двух гидроксиэтилакриламида, или GAA для синтеза соответствующего низкодисперсного гликополимера.

Затем гликополимер модифицируют на одном из его первичных аминов путем реакции с карбоксифлуоресцеином xito средним эфиром с получением флуоресцеина гликополимера. Заключительным этапом является связывание нативного гликополимера флуоресцеина с покрытыми лектином розовыми шариками с известной специфичностью связывания углеводов. В конечном счете, флуоресцентная микроскопия используется для анализа связывания гликополимеров с возникшими гранулами, подтверждая, что гликополимер обладает интересующим углеводом и помечен флуоресцентной меткой.

Преимущество полимеризации RAF по сравнению с существующими методами, в которых используются обычные свободнорадикальные полимеризации, заключается в том, что процесс WRATH представляет собой метод контрольной полимеризации, который сводит к минимуму количество цепей, производных от инициаторов. В результате получаются полимеры с заданной молекулярной массой и очень узким полидисперсионным штативом. Полимеризации могут быть применены к определенной смеси мономеров для получения специфических флуоресцентных гликополимеров.

Эти гликополимеры обладают определенными связующими способностями, которые можно проверить с помощью гранул, покрытых лектином. Эффективное получение флуоресцентных гликополимеров должно оказаться очень ценным для исследований в области гликобиологии в будущем. Для начала растворите два грамма лактобионической кислоты в трех миллилитрах безводного метанола.

Затем медленно добавляйте абсолютный этанол по каплям в раствор, пока он не станет мутным. Используйте ротационный испаритель для удаления всех растворителей. Повторите этот процесс три раза, чтобы получить 1,94 грамма лакто биоо на один пять лактонов с выходом 98%.

Добавьте раствор одного грамма лакто-биолактона в трех миллилитрах метанола к раствору A EMA и MEHQ в двух миллилитрах метанола. Далее добавляем один миллилитр триэтиламина и размешиваем смесь при комнатной температуре. Через 48 часов добавьте в смесь 20 миллилитров деионизированной воды и переложите ее в ротационный испаритель.

Выпарить до полного высыхания. Растворите остаток в 20 миллилитрах деионизированной воды и нанесите раствор на верхнюю часть анионообменной колонны размером 10 на 20 миллиметров. Поместите стакан, содержащий один миллиграмм MEHQ, под выпускное отверстие и вонзите колонку в стакан.

Набрав раствор в ротационном испарителе, растворите остаток в 20 миллилитрах деионизированной воды и добавьте один миллиграмм аликвоты ионообменной смолы. До тех пор, пока тест гидранта не будет отрицательным, проводят гидрантные тесты путем удаления одного микролитра раствора и нанесения его на тонкослойную хроматографическую пластину. Распылите на пластину 2%-ный раствор этанола и нагрейте до 90 градусов Цельсия в течение одной минуты на горячей плите.

Конечная точка достигнута, когда синий цвет не формируется. Далее отфильтруйте раствор через воронку из фриттированного стекла в пробирку. Заморозьте раствор при температуре минус 80 градусов по Цельсию, а затем переложите его в лиофилизатор для сублимационной сушки.

Растворите остаток в минимальном количестве метанола и осадите продукт, добавив минус 20 градусов Цельсия и безводный ацетон. Соберите осажденный L-A-E-M-A путем фильтрации через воронку из фриттированного стекла. Переведите воронку и осадите в вакуумный десиккат для сушки сначала из 0,5 грамма примерно 150 меш наночастиц оксида алюминия до одного миллилитра коммерческого класса HEAA в двухмиллилитровой пробирке.

Центрифугируйте пробирку при 300-кратном перегрузке в течение 30 секунд и используйте верхний слой в качестве ингибитора HEAA, тщательно растворите 32,8 миллиграмма L-A-E-M-A, 1,7 миллиграмма EMA и 27,5 микролитра ингибитора HEAA и 0,4 миллилитра деионизированной воды и переложите раствор в хорошо очищенную одномиллилитровую боковую трубку. Затем добавьте в пробирку 50 микролитров реактива рафт и 50 микролитров реагента-инициатора и перемешайте, слегка постукивая по боковой стороне пробирки с закрытым клапаном. Подключите трубку к вакуумной линии и заморозьте содержимое с помощью ванны с сухим льдом и этанолом.

Затем уменьшите давление в трубке до 50 миллиторр с помощью насоса и закройте клапан. Снимите ванну с сухим льдом и дайте содержимому оттаять. Повторите цикл замораживания, вакуумирования и размораживания еще дважды.

Осмотрите пробирку, чтобы убедиться, что содержимое полностью растворилось, и при необходимости аккуратно сработайте вихрь. Перед усадкой извлеките закрытую трубку из вакуумной линии и поместите ее в прозрачный пластиковый вакуумный пакет. Откачайте воздух из мешка с помощью пластикового ручного насоса.

Затем поместите пакет на закрытую водяную баню при температуре 70 градусов Цельсия на 24 часа. Далее извлеките пробирку из пакета и перенесите ее содержимое в диализный мешок с отсечкой по молекулярной массе 3 500 дальтон. Поместите диализный мешок в стакан и проводите диализ против двух литров деионизированной воды в течение 24 часов.

Переложите содержимое диализного мешка в пробирку и поместите ее в морозильную камеру при температуре минус 80 градусов по Цельсию. После заморозки переложите в лиофилизатор и высушите. Чтобы получить пушистый белый гликополимер PMA LA EMA, сначала приготовьте раствор из пяти миллиграммов PMA LA EMA в 0,9 миллилитрах PBS.

Затем медленно добавьте 0,6 миллиграмма карбоксифлуоресцеина цина, средний этер в 100, микролитры диметилформамида в быстро перемешиваемый раствор, микропробирку и фольгу, и медленно перемешивайте в течение 16 часов при комнатной температуре, переложите раствор в диализный мешок с молекулярной массой отсечки 3 500 дальтон. Поместите пакет в стакан и диализуйте в двух литрах деионизированной воды в течение 16 часов, сохраняя его защищенным от света. Переложите содержимое диализного мешка в пробирку.

После замораживания раствора при минус 80 градусах Цельсия сублимационную сушку. Чтобы получить пушистый желтый флуоресцирующий гликополимер, меченный P-M-A-L-A-E-M-A, определяют число среднемолекулярной массы, массу, среднюю молекулярную массу и дисперсность гликополимеров с помощью системы ВЭЖХ. Сначала по 1,5 миллилитров PBS на 50 микролитров суспензии ery Krista galey lectin, покрытых шариками в центрифужной пробирке.

Затем центрифугируйте пробирку при 300-кратном перегрузке в течение одной минуты. Затем выбросьте надосадочную жидкость и повторите стирку еще дважды, прежде чем окончательно добавить 0,5 миллилитра PBS. Добавьте раствор трех микрограммов флуоресцеина, меченного PMA LA EMA, в шести микролитрах PBS в пробирку, содержащую покрытые лектином шарики.

Используйте флуоресцеин, меченный P-M-A-G-A-E-M-A, в качестве отрицательного контроля. Далее заверните трубочки в фольгу и выдержите их при комнатной температуре в течение одного часа. Центрифугируйте пробирку в течение одной минуты и выбросьте надосадочную жидкость.

Затем реус суспензируйте бусины в 1,5 миллилитрах свежего PBS и повторите стирку три раза. Наконец, суспендируйте шарики в 0,2 миллилитрах PBS Перенесите четыре микролитра взвешенных шариков в лунку иммунофлуоресцентного микроскопа. Задвижите и накройте стеклянной крышкой.

Изображения предметного стекла с помощью флуоресцентного микроскопа, оснащенного фильтром FITC с 10-кратным объективом и камерой. Гликополимеры анализировали методом гель-проникающей хроматографии. Полимеры, синтезированные без использования рафта, имеют гораздо более высокую дисперсность, чем полимеры, изготовленные с использованием рафта.

При мечении флуоресцеином внешний вид гликополимера меняется с белого на ярко-желтый цвет, проявляющийся под воздействием ультрафиолетового излучения. Раствор немеченного полимера остается темным, в то время как флуоресцеиновый меченый полимер светится ярко-зеленым цветом, подтверждающим наличие этикетки, специфическое связывание с лектиновыми шариками происходит только с полимерами, несущими висячие остатки сахара, светящиеся зеленым цветом при связывании, в то время как они остаются темными при обработке полимерами, не имеющими подвесных остатков сахара. Этот метод полимеризации на основе плота обеспечивает большую гибкость в выборе типа гликополимеров, которые могут быть синтезированы.

Последующее мечение гликополимеров также может быть достигнуто с помощью большого разнообразия флуоресцентных реагентов, способных реагировать с первичными средствами в водной среде. Исследователи в области гликобиологии могут использовать этот метод для получения очень универсальных и определенных гликополимеров. Эти гликополимеры могут быть использованы в качестве инструментов для изучения специфики связывания углеводов, например, наблюдаемой в дыхательном пути пациентов с муковисцидозом или вовлеченных во многие виды рака человека.