Простой Массовая считывания цифровых нуклеиновых кислот количественного определения Анализы

Общая цель данной процедуры заключается в упрощении считывания результатов анализа методом цифровой капельной ПЦР с использованием стандартного прибора для ПЦР в реальном времени для измерения суммарной флуоресценции анализа. Это достигается путем предварительной подготовки реакций амплификации интересующих образцов и двух стандартов с последующим формированием капель для разделения каждого образца на тысячи реакторов нанолитрового объема. На втором этапе капли инкубируют для амплификации нуклеиновых кислот внутри каждой капли.

Затем измеряют общую флуоресценцию каждого образца или стандарта с помощью стандартного QPC или амплификатора. Заключительным этапом является определение доли флуоресцентных капель в исследуемых образцах с использованием калибровочного графика, построенного по стандартным образцам. Для подтверждения эффективности данного метода можно использовать флуоресцентную микроскопию, чтобы независимо оценить точность количественного анализа методом измерения общей флуоресценции.

Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими способами, такими как подсчет капель, является то, что он не требует специализированного оборудования. Перед началом данной процедуры по подготовке анализа необходимы все реагенты, описанные в тексте протокола, а также два стандарта. Первый — отрицательный контроль без матрицы, например, вода, свободная от нуклеаз, и второй — стандарт с высокой концентрацией матрицы, например, lambda DNA. Денатурируйте 3.3 µL каждого стандарта, добавив 3.3 µL буфера для денатурации в пробирку для qPCR.

Инкубируйте при комнатной температуре в течение трех минут. Погасите каждую реакцию, добавив 3.3 µL нейтрализующего буфера. Аналогичным образом денатурируйте 3.3 µL интересующей матрицы, добавив 3.3 µL буфера для денатурации и инкубируя при комнатной температуре в течение трех минут.

Остановите реакцию, добавив 3.3 µL нейтрализующего буфера. Чтобы уменьшить количество ложноположительных результатов, приготовьте по 11 µL мастер-смеси на каждый образец. Перед формированием капель подвергните мастер-смесь воздействию УФ-излучения.

Сначала приготовьте по 10 µL смеси премикса для каждого образца в прозрачной пробирке объемом 0,5 мл или 1,5 мл на льду. Смесь премикса состоит из рандомизированных олигонуклеотидов, реакционного буфера для B-S-A-D-N-A полимеразы, dn, NTP и воды, свободной от нуклеаз. Поместите пробирку в воду на льду и подвергните воздействию УФ-излучения.

Добавьте красящий агент для dsDNA и контрольную диету в предварительную смесь. Добавьте ДНК-полимеразу PHI 29 в последнюю очередь, чтобы полимераза не подвергалась воздействию уровней pH значительно выше или ниже 7,5. Тщательно перемешайте, затем объедините 10 µL денатурированного шаблона или стандарта и 10 µL основной смеси, тщательно перемешав.

Поскольку капли могут быть очень чувствительны к статическому электричеству и напряжению сдвига, экспериментатору следует снять одежду, которая может вызвать накопление статического электричества, и заземлиться перед формированием капель. Микрофлюидное устройство, использованное в данной демонстрации, было изготовлено внутри лаборатории и имеет один вход для масла и два входа для водных растворов с узлом фокусировки потока для генерации капель. Используйте два шприцевых насоса для контроля скоростей потока 55 µL масла с сурфактантом и 20 µL реакционной смеси через микрофлюидный чип.

Для получения наноклеток объемом 20 001 нл одним из самых сложных этапов является сбор капель без нарушения эмульсии. Важно дозировать жидкость медленно и, желательно, использовать наконечник с широким отверстием.

Соберите все капли для каждого образца в ПЦР-пробирки. С помощью наконечника с широким отверстием и очень медленным дозированием внесите по 30 µL масла в чистые ПЦР-пробирки с оптическими крышками. Перенесите 20 µL капель поверх слоя масла.

Соблюдение постоянства объемов обеспечивает максимальную точность анализа. Плотно закройте крышки пробирок, так как неплотно закрытые крышки приведут к испарению масла; держите пробирки с эмульсией за верхнюю часть, как можно дальше от самой эмульсии. Для изотермической амплификации можно использовать ПЦР-термоциклер, прибор для количественной ПЦР в реальном времени (qPCR) или нагревательную плитку.

В данной демонстрации используется термоциклер A-Q-P-C-R. Инкубируйте образцы в течение семи часов при 30 °C и инактивируйте в течение одной минуты при 75 °C. Сразу после завершения реакции и активации.

Измерьте уровни флуоресценции для всех образцов с помощью термоциклера для QPCR. Для каждого образца разделите интенсивность флуоресценции ДС-ДНК-связывающего красителя на интенсивность флуоресценции референсного красителя.

Вычтите фоновую флуоресценцию или нормированную флуоресценцию отрицательного контроля (без матрицы) из всех образцов. Постройте линейную калибровочную кривую, используя скорректированные значения флуоресценции стандартов. Стандарт отрицательного контроля представляет флуоресценцию образца с 0% флуоресцентных капель, а стандарт с высокой концентрацией матрицы — с максимальным содержанием.

Измерение флуоресценции представляет собой определение ожидаемой флуоресценции для образца со 100% флуоресцентными каплями с использованием соответствующей стандартной кривой. Прогнозируются промежуточные соотношения положительных и отрицательных капель на основании их общей флуоресценции. Этот метод использует стандартный прибор для ПЦР в реальном времени для измерения общей флуоресценции цифровых анализов на основе капель.

Флуоресцентные и нефлуоресцентные капли предварительно смешивали в различных соотношениях, после чего проводили сравнение общей флуоресценции с долей положительных капель. Как и ожидалось, общая флуоресценция и количество положительных капель линейно зависят от входной доли флуоресцентных капель. Прогнозируемые соотношения, рассчитанные на основе стандартов, сравнивали с ожидаемыми входными долями флуоресценции.

Линия указывает ожидаемое значение при условии линейной зависимости. Результаты демонстрируют высокую точность количественного определения соотношения капель в динамическом диапазоне двух порядков. Для проверки данного метода в реальном количественном анализе амплификации всего генома использовались уровни флуоресценции и доли положительных капель цифрового метода анализа капель.

Был проведен анализ MDA с использованием возрастающих концентраций матрицы Lambda DNA. Линия показывает ожидаемую флуоресцентную фракцию с использованием распределения Пуассона для моделирования экспериментальных данных. Представлены репрезентативные флуоресцентные изображения капель; как общая флуоресценция, так и фракция положительных капель в цифровых образцах MDA масштабируются в соответствии с ожидаемым средним количеством матриц на каплю, что указывает на то, что общий сигнал может достоверно отражать результат цифрового анализа.

Данный метод может быть полезен и для других видов цифрового анализа, таких как цифровая ПЦР, за счет ускорения, параллелизации и упрощения считывания результатов анализа.