Простой Массовая считывания цифровых нуклеиновых кислот количественного определения Анализы

Общая цель этой процедуры заключается в упрощении считывания цифровых анализов капель с помощью обычного прибора для ПЦР в реальном времени для измерения объемной флуоресценции анализа. Это достигается путем подготовки реакций амплификации интересующих образцов, двух стандартов и формирования капель для разделения каждого на тысячи нанолитровых реакторов. Второй шаг заключается в инкубации капель для амплификации нуклеиновых кислот в каждой капле.

Затем объемная флуоресценция каждого образца или стандарта измеряется с помощью стандартного QPC или термоамплификатора. Заключительным этапом является прогнозирование доли флуоресцентных капель в интересующих образцах с помощью стандартной кривой, созданной из стандартных образцов. Для проверки эффективности этого метода можно использовать флуоресцентную микроскопию для независимой оценки эффективности количественного определения объемного флуоресцентного анализа.

Основное преимущество этой методики перед существующими методами, такими как подсчет капель, заключается в том, что она не требует специализированных приборов перед началом этого анализа. Для всех необходимых реагентов, как описано в тексте протокола, требуются два стандарта. Во-первых, без контроля матрицы, такой как вода, свободная от нуклеаз, и одна высокая концентрация матрицы, такая как лямбда, ДНК, денатурировать 3,3 микролитра каждого стандарта с 3,3 микролитрами буфера для денатурации в пробирке A-Q-P-C-R.

Выдержите его при комнатной температуре в течение трех минут. Закалите каждый 3,3 микролитрами нейтрализующего буфера. Аналогично денатурировать 3,3 микролитра исследуемого шаблона с 3,3 микролитрами денатурационного буфера в инкубации комнатной температуры в течение трех минут.

Закалить 3,3 микролитрами нейтрализующего буфера. Приготовьте 11 микролитров исходной смеси на образец для меньшего количества ложных срабатываний. Подвергайте мастер-смесь воздействию ультрафиолетового излучения перед формированием капель.

Сначала приготовьте 10 микролитров смеси премикса на образец в прозрачной пробирке объемом 0,5 миллилитра или 1,5 миллилитра на льду. Смесь предварительного смешивания состоит из рандомизированного олиго, буфера для реакционной реакции B-S-A-D-N-A, DN, NTP и воды, свободной от нуклеазы. Поместите трубку в воду на льду и подвергните воздействию ультрафиолетового излучения после воздействия ультрафиолета.

A-D-S-D-N-A связывающий краситель и референтная диета к смеси премиксов. Добавьте ДНК-полимеразу PHI 29 в последнюю очередь, чтобы гарантировать, что полимераза не столкнется с уровнями pH намного выше или ниже 7,5. Хорошо перемешиваем, соединяем 10 микролитров денатурированного шаблона или стандартного и 10 микролитров мастер-смеси, хорошо перемешиваем.

Поскольку капли могут быть очень чувствительны к статическому электричеству и чистому стрессу, экспериментатор должен снять одежду, которая может вызывать статическое электричество, и заземлиться на месте, прежде чем образовать капли. Микрофлюидное устройство, использованное для этой демонстрации, было изготовлено компанией и имеет масляный вход и два водных входных отверстия с фокусирующим потоком переходом для генерации капель. С помощью двух шприцевых насосов контролируйте расход 55 микролитров масла с поверхностно-активным веществом и 20 микролитров реакционной смеси через микрофлюидный чип.

Чтобы получить капли размером 20 001 нанолитр, одним из самых сложных этапов является сбор капель без нарушения эмульсии. Важно делать пипетку медленно и желательно. Используйте широкий наконечник доски.

Соберите все капли в ПЦР-пробирки для каждого образца. Аликвотировать 30 микролитров масла в свежие ПЦР-пробирки с оптическими колпачками с помощью широкого наконечника и пипетировать очень медленно. Перелейте 20 микролитров капель поверх масла.

Постоянные объемы обеспечивают максимальную точность анализа. Плотно закройте крышки трубок, так как незакрепленные крышки позволят маслу испарять трубки с эмульсией с верхней части трубки как можно дальше от эмульсии. Для изотермической амплификации можно использовать термоамплификатор для ПЦР, термоамплификатор A-Q-P-C-R или горячую пластину.

В этой демонстрации используется термоамплификатор A-Q-P-C-R. Инкубируйте образцы в течение семи часов при 30 градусах Цельсия и инактивируйте в течение одной минуты при 75 градусах Цельсия. Сразу после реакции и активации.

Измеряйте уровни дифлуоресценции для всех образцов с помощью термоамплификатора QPCR. Для каждого образца. Разделите интенсивность флуоресценции красителя, связывающего ДНК D DS, на интенсивность флуоресценции референсного красителя.

Вычтите фоновую флуоресценцию или нормализованную флуоресценцию контроля без шаблона из всех образцов. Создание линейной стандартной кривой с использованием корректирующих флуоресцентных измерений из стандартов. Контрольный стандарт без матрицы представляет собой флуоресценцию для образца с 0% флуоресцентных капель и высокой концентрацией матрицы.

Измерение флуоресценции — это ожидаемая флуоресценция для образца со 100% флуоресцентными каплями с использованием соответствующей стандартной кривой. Прогнозирование промежуточных соотношений положительных и отрицательных капель на основе их объемной флуоресценции. В этом методе используется обычный прибор для ПЦР в реальном времени для измерения объемной флуоресценции цифровых анализов на основе капель.

Флуоресцентные и нефлуоресцентные капли предварительно смешивали в различных соотношениях, и сравнивали объемную флуоресценцию и фракцию положительных капель. Как и ожидалось, объемная флуоресценция и количество положительных капель линейно масштабируются в зависимости от входной доли флуоресцентных капель. Прогнозируемые соотношения, основанные на стандартах, сравнивались с ожидаемыми флуоресцентными входными фракциями.

Линия указывает на математическое ожидание при заданной линейной зависимости. Результаты показывают хорошую производительность при количественном определении соотношения капель в двух логарифмах динамического диапазона. Для апробации этого метода в реальном количественном анализе амплификации всего генома, уровней флуоресценции и фракций положительных капель цифровой капли.

Измеряли анализ MDA с увеличением концентраций матричной ДНК Lambda. Линией обозначена ожидаемая флуоресцентная фракция с использованием распределения пуассанса для моделирования данных эксперимента. Репрезентативные флуоресцентные изображения капель демонстрируются как в объемной флуоресцентной, так и в положительной фракции капель из цифровых образцов MDA, как и ожидалось, с использованием среднего шаблона на каплю, что указывает на то, что объемное считывание может точно отражать результат цифрового анализа.

Этот метод может принести пользу другим цифровым анализам, таким как цифровая ПЦР, за счет ускорения распараллеливания и упрощения считывания анализа.