Microbead Имплантация в данио рерио эмбрионов

Общая цель следующего эксперимента заключается в использовании имплантации микросфер для внесения изменений в локальную среду тканей в конкретных пространственных и временных точках в ходе эмбриогенеза данио-рерио. Это достигается путем предварительной подготовки лотка для имплантации сфер для обеспечения точного манипулирования и введения микросфер. На втором этапе икра данио-рерио инкубируется до достижения желаемой стадии развития.

Затем микросферы подготавливают в соответствующих экспериментальных растворах и осторожно переносят в нужное место внутри эмбриона. В конечном итоге имплантацию микросфер можно провести без нарушения нормального развития Danio rerio, что позволяет оценить влияние интересующих молекул на эмбриогенез рыбок-зебрафиш. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биологии развития, например, как различные молекулы влияют на процесс органогенеза?

Как правило, лицам, которые только начинают осваивать этот метод, потребуется время, так как навык работы с микросферами приобретается с практикой. Для подготовки лотка для имплантации микросфер сначала нагрейте свежеприготовленный 2% раствор aro в течение 90 секунд. Используйте коническую колбу объемом 250 мл, аккуратно вращая колбу каждые 30 секунд, чтобы гель не закипел и не вытек.

Затем поместите крышку чашки Петри размером 60×15 мм в чашку размером 150×15 мм так, чтобы внутренняя сторона крышки была обращена вверх. Затем, придерживая крышку меньшей чашки Петри указательным пальцем, залейте горячий агарозный гель в большую чашку.

Позвольте под меньшей крышкой образоваться тонкому слою агроза, чтобы предотвратить образование конденсата и облегчить визуализацию бусин под микроскопом по мере охлаждения агроза. До того как гель затвердеет, медленно погрузите форму для лунки в верхнюю часть геля, чтобы облегчить последующее размещение эмбрионов. После затвердевания геля осторожно извлеките форму для лунки с помощью микрошпателя.

Затем добавьте в чашку раствор E3 и храните ее при температуре 4 °C. Для сбора эмбрионов данио-рерио наполните камеру для спаривания системной водой. Затем установите разделитель посередине камеры и поместите взрослых самцов и самок данио-рерио в соответствующие части камеры.

На следующее утро соберите оплодотворенные икринки с помощью сита с мелкой проволочной сеткой. Переверните сито над чистой чашкой Петри диаметром 10 сантиметров и промывайте сетку тонкой струей раствора E three до тех пор, пока в сите не останется икринок, а в чашке не окажется примерно 25 миллилитров раствора E three. Затем распределите икринки по нескольким чашкам по 50–60 штук в каждую, чтобы избежать перенаселения, и инкубируйте их в растворе E three при температуре 28.5 градусов Цельсия. Перед имплантацией микросфер инкубируйте икринки в соответствующем объеме раствора исследуемой молекулы или контрольного носителя в течение необходимого периода времени.

Затем, когда эмбрионы достигнут нужной стадии развития, с помощью тонкого пинцета удалите их хорионы и поместите рыбок зебрани в фильтрованный раствор Рингера, дополненный антибиотиками, на 10 минут для акклиматизации. Перенесите микросферы в предварительно подготовленный планшет для микросфер, установленный в лоток для имплантации, и промывайте микросферы раствором Рингера в течение 10 минут.

В течение 50 минут после промывки микросфер расположите эмбрионы по одному в лунках лотка для имплантации таким образом, чтобы область имплантации микросфер была доступна. С помощью вольфрамовой иглы сделайте небольшой разрез на эмбрионе, затем нажмите на грушу микрокапиллярной переносной пипетки, чтобы осторожно втянуть микросферу в капилляр, и отпустите давление, чтобы переместить микросферу в лоток для имплантации для облегчения манипуляций с ней. Осторожно подтолкните микросферу, чтобы она погрузилась в раствор Рингера внутри формы.

Затем с помощью микроиглы переместите микросферу на эмбрион и внутрь разреза. В завершение используйте инструмент-«вибриссу» (whisker tool), чтобы отодвинуть микросферу от места разреза, чтобы она не была вытолкнута в процессе заживления. Успешность имплантации микросферы можно сразу оценить с помощью стереомикроскопа: в этом случае микросфера будет стабильно зафиксирована в ткани.

В данном эксперименте одиночные микросферы двух разных размеров, промытые только раствором Рингера, имплантировались в эмбрионы zebrafish на стадии хвостовой почки или на более поздних этапах миогенеза, чтобы гарантировать, что положение микросферы не сместилось в течение эксперимента из-за эндогенного морфогенеза тканей. Образцы эмбрионов можно визуализировать с помощью серийной фотографии в течение всего жизненного цикла или проверять через определенные интервалы времени, как показано на изображениях имплантации микросфер. В отсутствие каких-либо конъюгатов можно добиться введения малых молекул без грубых морфологических эффектов в процессе нормального развития эмбриона рыбы SPR.

После выполнения данной процедуры можно применить другие методы, такие как гибридизация in situ на целом препарате (Whole Mount In Situ Hybridization), чтобы изучить влияние микросфер на экспрессию генов. В целом, понимание положения сферы с течением времени имеет решающее значение для интерпретации результатов, например, при оценке воздействия малых молекул на целевую ткань или процесс развития.