Простой и Компьютерный обонятельных тестирование для мышей
15 июня 2015 г.
Мы представляем простой и непредвзятый обонятельный тест на мышах. С помощью этого протокола обонятельная дискриминация, предпочтение, избегание и чувствительность к новому запаху по сравнению с водой могут быть оценены в ходе отдельных поведенческих сеансов. Этот метод показан для одного экспериментатора, а анализ основан на компьютерной обработке видео.
Общая цель следующего эксперимента заключается в проверке врожденной обонятельной дискриминации, обонятельных предпочтений или избегания, а также обонятельной чувствительности у мышей. Это достигается путем воздействия на мышь новым аттрактантом или репеллентом, а также нейтральным запахом (водой). Одновременно с этим видеокамера записывает сеанс поведенческого анализа.
Затем видео анализируют в Image J с использованием предоставленных макросов для определения времени, проведенного в зонах с запахом и водой. Результаты компьютерного анализа с последующим апостериорным сравнением позволяют выявить предпочтение или избегание запахов по сравнению с водой у различных генотипов. Основным преимуществом данного метода ольфакторного тестирования перед использованием специализированных арен и систем подачи запахов является применение привычной арены, что обеспечивает быстрое выполнение эксперимента и простоту подготовки.
Кроме того, в данной работе используется недорогое оборудование. Процедуру продемонстрирует Эммануэль Абри, аспирант моей лаборатории. Для этого эксперимента используйте самцов мышей линий C57BL/6 дикого типа и трансгенных мышей в возрасте от трех до пяти месяцев. В данной демонстрации используются две нокаут-линии и контрольные животные из одного помета.
В качестве экспериментальных арен используйте чистые стерилизованные клетки для мышей с трехсантиметровым слоем подстилки. Затем подготовьте систему видеосъемки. Установите камеру на специальном штативе на высоте 58 сантиметров над полом клетки.
Сделайте на столемету пометки, чтобы обозначить положение клетки. Для получения центрального изображения настройте камеру на запись видео с разрешением 320 на 240 пикселей с частотой примерно 15 кадров в секунду. Для подготовки к тесту по возможности используйте концентраты каждого запаха, хранящиеся в растворителе.
Для теста на предпочтение приготовьте 10% масс./об. раствор арахисовой пасты в арахисовом масле. Для теста на избегание используйте раствор 98% метилбутировой кислоты. Для теста на чувствительность соберите мочу самки мыши того же штамма за один-два дня до начала теста.
Зафиксируйте самку так, чтобы ее брюшко находилось над решеткой клетки, и соберите капли мочи в пластиковый приемник. Соберите образцы от нескольких самок для нормализации. Для учета индивидуальной изменчивости поместите все образцы в пробирку объемом 1,5 мл и храните при температуре -20 °C.
Для начала привыкания поместите животное в чистую клетку и дайте ему обследовать пространство. В течение пяти минут условия в тестовой клетке должны соответствовать условиям в домашней клетке. Повторяйте фазу привыкания один раз в каждый день тестирования; по окончании периода привыкания начните запись и внесите пипеткой 60 µL приятного аромата.
В данном случае на одну из стен нанесите арахисовое масло, а на противоположную стену с помощью пипетки нанесите такое же количество воды. В качестве нейтрального запаха нанесите капли примерно на 10 сантиметров выше каждой стены. Теперь позвольте животному исследовать пространство в течение двух минут, после чего остановите запись и верните мышь в домашнюю клетку.
Повторите эту процедуру для каждой мыши, подлежащей тестированию. Всегда используйте новые тестовые клетки. Через три-пять дней после проведения всех тестов на предпочтение проведите тест на избегание, используя новую тестовую клетку.
Для каждой мыши проведите тест на избегание. Процедура аналогична тесту на притяжение, за исключением того, что приятный запах заменяют запахом избегания, которым является 2-метилбутановая кислота. Для теста на чувствительность одну и ту же клетку можно использовать повторно в разных пробах для одной и той же мыши.
Отметьте сторону клетки, прилегающую к воде, и подготовьте бумагу, смоченную в 70% этаноле, для очистки коротких стенок между испытаниями. В день эксперимента приготовьте четыре концентрации мочи, используя серию десятикратных разведений. Используя дважды дистиллированную воду, как при тесте на избегание, приучайте каждое животное к тестовой клетке в течение пяти минут.
Затем подвергните каждую мышь воздействию мочи, начиная с максимального разведения 1:10 000. Во время записи нанесите разведенную мочу на одну стенку тестовой клетки, а воду — на противоположную. Как и в других тестах, позвольте животному исследовать окружающую среду.
В течение двух минут. После этого перенесите животное в чистую клетку для мышей. Когда все животные подвергнутся воздействию самой низкой концентрации, очистите стенки всех тестовых клеток и повторите тест для каждой мыши, используя мочу со следующей по возрастанию концентрацией.
Продолжайте этот процесс до тех пор, пока не будет протестирована чистая моча. После сбора всех данных для эксперимента откройте видео в программе ImageJ для корректировки и обработки; подробности этих действий приведены в текстовом протоколе с использованием описанных методик. Две разные нокаутные линии.
Группы B и C сравнивали с контрольной группой A, состоявшей из однопометников. Для сравнения времени, проведенного между запахом и водой внутри генотипов, использовали двухвыборочный t-критерий Стьюдента (без направленного анализа) при равной или неравной дисперсии. Поведение различных генотипов сравнивали с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA). Обе экспериментальные группы, B и C, не проявили предпочтения к привлекательному запаху. В тесте на избегание реакция на отталкивающий запах 2-метилбутировой кислоты была ожидаемой для групп A и B, однако группа C не проявила поведения избегания по отношению к этому запаху.
В тесте на чувствительность порог привлечения определяли путем вычитания времени, проведенного с мочой, из времени, проведенного с водой, при этом предпочтение мочи перед водой наблюдалось при разведении 1 к 1000. В то время как обем экспериментальным группам, B и c, потребовалась концентрация в 100 раз выше для проявления предпочтения. После освоения эта методика может быть выполнена за несколько часов при условии правильного проведения; затем, следуя данной процедуре, можно применять другие методы, такие как ольфакторное обучение и угашение, для изучения ольфакторной пластичности и обучения.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлен простой тест обоняния для мышей, позволяющий оценить обонятельную дискриминацию, предпочтение, избегание и чувствительность к новому запаху по сравнению с водой. Метод эффективен для одного экспериментатора и основан на компьютерном видеоанализе.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Поведенческий анализ
- Ольфакторное тестирование
Теоретическая часть
- Целью эксперимента является оценка врожденного обонятельного поведения у мышей.
- Метод предполагает воздействие нового запаха и нейтрального контроля (воды).
- Поведение регистрируется и анализируется для определения предпочтений или отвращений.
- Данный метод предполагает использование привычной для мышей среды, что повышает достоверность результатов.
Цель исследования
- Для оценки обонятельной дискриминации у мышей.
- Для оценки обонятельного предпочтения и поведения избегания.
- Для измерения обонятельной чувствительности к новым запахам.
Используемые методы
- Мышей подвергают воздействию нового аттрактанта или апеллянта и воды.
- Поведенческие сессии записываются с помощью видеокамеры.
- Видеоанализ выполняется с использованием программного обеспечения Image J с применением макросов.
- Результаты анализируются для определения времени, проведенного с каждым запахом.
Основные результаты
- Результаты указывают на предпочтительное или избегающее поведение по отношению к запахам по сравнению с водой.
- Поведенческие реакции различаются у разных генотипов.
- Метод позволяет быстро подготовить и завершить эксперименты.
- Компьютеризированный анализ повышает точность результатов.
Выводы
- Ольфакторный тест является надежным методом оценки обонятельного поведения у мышей.
- Использование знакомой арены упрощает процесс проведения эксперимента.
- Данный подход может быть полезен для различных поведенческих исследований в области нейробиологии.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Нарушение обонятельной функции является ранним биомаркером в моделях нейродегенеративных заболеваний, что делает надежные тесты обоняния у грызунов критически важными для валидации мишеней при разработке препаратов для ЦНС. Данный метод позволяет проводить быструю и воспроизводимую оценку врожденного восприятия запахов и чувствительности без ограничения в еде или воде, что способствует высокопроизводительному скринингу генетических или фармакологических вмешательств. Путем количественного определения поведенческих реакций на аттрактанты, аверсанты и порогов чувствительности метод обеспечивает механистическое снижение рисков для мишеней, вовлеченных в дисфункцию обонятельной сети.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем установления связи между генотипом и обонятельным поведением, что обеспечивает функциональную валидацию мишеней в обонятельных путях.
- Операционная ценность: использование знакомой среды и минимальная габитуация снижают вариабельность, вызванную стрессом, и повышают воспроизводимость анализа для разных генотипов.
- Прогностическая ценность: выявление измененного предпочтения или избегания запахов у нокаутных моделей, что способствует раннему снижению рисков при работе с мишенями, связанными с нейродегенеративными или психиатрическими заболеваниями.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получать количественные показатели затраченного времени с помощью компьютерного анализа в ImageJ, что обеспечивает объективное сравнение реакций на запахи в различных экспериментальных группах.
- Практическая ценность: требует только стандартных клеток, подстилки, ароматизаторов и видеокамеры, что позволяет масштабировать метод в исследовательских лабораториях без использования специализированного оборудования.
- Прогностическая ценность: способствует определению зависимости «доза-ответ» при тестировании чувствительности, что помогает оптимизировать поиск перспективных соединений путем определения эффективных диапазонов концентраций для вызова поведенческих реакций на одоранты.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Соответствует данным о дефиците обоняния у людей как продромальном биомаркере, что повышает трансляционную значимость мышиных моделей в исследованиях нейродегенеративных заболеваний.
- Операционная ценность: Позволяет проводить лонгитюдное тестирование чувствительности с помощью серий разведений, что способствует отслеживанию прогрессирования заболевания в доклинических исследованиях эффективности.
- Прогностическая ценность: Помогает определить генотип-специфические пороги распознавания запахов, что способствует стратификации пациентов и выбору мишеней, соответствующих биомаркерам.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод вписывается в континуум поиска — от проверки гипотезы о мишени до идентификации перспективных соединений (лидов), обеспечивая поведенческие показатели, которые позволяют принять решение о целесообразности дальнейшей разработки до инвестирования в синтез соединений.
- Открытия в биологии: Обеспечивает проверку гипотез путем измерения врожденной обонятельной дискриминации и предпочтений, что позволяет уточнить функцию генов в путях сенсорной обработки.
- Скрининг: Обеспечивает стандартизированные количественные результаты (время пребывания в зонах с запахом и водой), что позволяет надежно сравнивать эффекты различных соединений или генотипов.
- Аналитика: Компьютерный анализ обеспечивает воспроизводимые измерения на основе пороговых значений, что способствует статистическому сравнению различных условий обработки.
- Трансляционные исследования: Обеспечивает преклиническую преемственность путем моделирования потери обонятельной чувствительности — признака, позволяющего прогнозировать клиническую нейродегенерацию.
- Корпоративное повторное использование: Возможность повторного применения для различных типов тестов (предпочтение, избегание, чувствительность) и линий мышей, что делает метод платформенным решением, а не одноразовым анализом.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает точность прогнозирования при валидации мишеней за счет снижения механистической неопределенности в функционировании обонятельных цепей.
- Операционная ценность: Обеспечивает стандартизацию и воспроизводимость благодаря фиксированному времени воздействия, слепому видеоанализу и внутреннему контролю с использованием воды.
- Стратегическая ценность: Повышает эффективность использования капитала, обеспечивая быструю сортировку мишеней с помощью недорогого и высоковоспроизводимого поведенческого фенотипирования.
- Влияние на портфель: Обосновывает решения по продвижению проектов с учетом рисков путем выявления мишеней, модуляция которых восстанавливает или воспроизводит обонятельные фенотипы.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с грызунами, навыки поведенческого наблюдения и владение базовым программным обеспечением для видеотрекинга (ImageJ).
- Результаты зависят от стабильного освещения, расположения камеры (58 cm над клеткой) и правильного приготовления одорантов (например, разведений арахисового масла или серий разведений мочи).
- Необходима стандартизация протоколов привыкания между членами группы и проведение слепого анализа для минимизации систематической ошибки оператора.
- Адаптация метода для различных модельных систем требует подтверждения релевантности одорантов (например, использования видоспецифических феромонов или аверсантов).
- Практическое ограничение: чувствительность анализа зависит от точности подачи одоранта и тщательной очистки между испытаниями для предотвращения перекрестного загрязнения, что особенно важно при тестировании чувствительности.
