Planar градиентной диффузионной системы по расследованию хемотаксис в 3D коллагеновой матрице

Общая цель этой процедуры заключается в создании планерной градиентной диффузионной камеры для исследования химиотерапии в 3D-коллагеновой матрице. Это достигается путем предварительного изготовления 3D-формы из силикона с использованием камеры для визуализации живых клеток. Второй шаг – изготовление гидрофильных и гидрофобных покровных накладок и сборка из них 3D силиконовой формы.

Далее смесь коллагеновых клеток добавляется в центральный отсек и дается полимеризоваться. Заключительным этапом является удаление гидрофобных покровных стекол из формы после инкубации и добавление простой среды в один резервуар и среды с химиоаттрактантом в другой резервуар. В конечном счете, конфокальная микроскопия используется для отслеживания хемотаксиса клеток с течением времени и визуализации смещения движения клеток в коллагеновом матриксе.

Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как камера Бойна и микроатлетика, заключается в том, что он позволяет легко исследовать миграцию в 3D-пространстве с помощью простого градиента диффузии, не используя одноразовую пипетку. Отмерьте 150 микролитров аминокислотного селина A-P-T-M-S и вылейте его в 50-миллилитровую пробирку. Затем добавьте в пробирку 30 миллилитров 100% этанола с помощью второй одноразовой пипетки, и закройте крышкой.

Встряхните раствор в течение двух минут, чтобы обеспечить полное перемешивание. Затем налейте раствор в стеклянную чашку Петри и отставьте ее в сторону. Далее налейте 15 миллилитров 100% этилового спирта во вторую чашку Петри и поместите ее вместе с первой чашкой с помощью новой одноразовой пипетки.

Отмерьте 30 миллилитров деионизированной воды и перелейте раствор в 50-миллилитровую пробирку. Далее с помощью новой одноразовой пипетки добавьте в тюбик 1,875 миллилитра глюкозного альдегида и закройте крышку. Перемешайте раствор в течение двух минут, а затем вылейте смесь в третью чашку Петри.

С помощью щипцов достаньте 1 22 миллиметровую круглую стеклянную крышку и промойте обе стороны смесью 100% этанола. С помощью одноразовой пипетки поместите стеклянную крышку для полоскания в первую посуду, содержащую аминоселин, и дайте ей постоять в растворе в течение пяти минут с помощью щипцов. Выньте крышку стекла и снова промойте ее 100% этанолом.

Затем опустите промытое стекло, накройте крышкой, опустите в посуду с глутаральдегидом и отставьте ее в сторону на 30 минут. Через 30 минут снимите стеклянную крышку с помощью щипцов и промойте ее деионизированной водой. Поместите промытый чехол на салфетку, чтобы она сохла в течение ночи при комнатной температуре.

Чтобы приготовить гидрофобные покровные листы, сначала добавьте 500 микролитров ТТС, 100 микролитров уксусной кислоты и 19,4 миллилитров хайна в 50 миллилитровую трубку и перемешайте ее в течение двух минут. Затем перелейте раствор в стеклянную чашку Петри и с помощью чистых щипцов опустите одну стеклянную крышку, вставьте в приготовленный раствор и оставьте его там на две минуты. Через две минуты извлеките стеклозащитное стекло с помощью щипцов и промойте его деионизированной водой с помощью одноразовой пипетки, поместите защитное стекло на салфетку и дайте ему высохнуть при комнатной температуре в течение ночи.

Храните высушенные крышки в пластиковой чашке Петри до тех пор, пока они не понадобятся для начала, соберите камеру визуализации живых клеток, как описано в сопроводительном текстовом протоколе. Далее смешайте растворы силиконовых эластомеров согласно инструкции производителя, чтобы получилось пять миллилитров эластомера. Затем с помощью одноразового лабораторного шпателя медленно залейте раствор силиконового эластомера в камеру визуализации живых клеток, чтобы не потревожить компоненты пресс-формы.

Отложите форму в безопасное место, чтобы сохранить комнатную температуру на ночь. На следующее утро вытащите форму с помощью щипцов и осторожно извлеките обработанный алюминиевый металлический кубик из формы. Далее подойдите к раковине и промойте плесень деионизированной водой, а затем поместите форму на бумажное полотенце для просушки.

После высыхания используйте универсальный нож, чтобы вырезать щели на расстоянии 2,34 миллиметра друг от друга от каждого продольного конца внутри силиконовой формы. Перед использованием убедитесь, что форма остается в безопасном и сухом месте до тех пор, пока она не понадобится для эксперимента. Промойте форму 90% этанолом и поместите форму в чашку Петри, наполненную деионизированной водой, чтобы оставить на ночь.

На следующее утро переложите форму на бумажное полотенце и дайте ей высохнуть на воздухе, пока форма сохнет. Используйте высокоточный алмазный инструмент для вырезания квадрата. Гидрофильная крышка скользит в два прямоугольника, чуть больше 3,95 миллиметра на 5,99 миллиметра.

Затем вставьте каждую из вырезанных прямоугольных крышек в прорези, разрежьте в силиконовую форму, переверните форму вверх дном и нанесите вакуумную смазку по дну силиконовой формы с помощью одноразовой пипетки. Затем переверните форму обратной стороной вверх и прижмите дно формы к круглому стеклофильному стеклозащитному колпачку. Для создания уплотнения приготовьте смесь сред и химиоаттрактанта в пробирке объемом 15 миллилитров в нужной концентрации, пипеткой введите пять миллилитров смеси в новую миллилилитровую пробирку и пять миллилитров простой среды во вторую пробирку.

Переместите обе трубки на водяную баню, нагретую до 37 градусов Цельсия. Далее пипеткой 30 микролитров 10 XPBS в микроцентрифужную пробирку. Добавьте шесть микролитров одного обычного раствора гидроксида натрия в ту же микроцентрифужную пробирку и делайте вихрь в течение 15 секунд.

Затем добавьте 18 микролитров желто-зеленого флуоресцентного карбоксилата, модифицированные микросферы в микроцентрифужную пробирку и 168,3 микролитра ледяного льда. Тип первый коллаген крысиного хвоста. Перемешайте смесь в течение 30 секунд.

Далее добавляем 77,7 микролитров нужной ячейки. Наберите в два раза от 10 до шести ячеек на миллилитр в среду в микроцентрифужную пробирку и перемешайте. С помощью наконечника для пипетки в течение 20 секунд внесите 300 микролитров смеси коллагеновых клеток в центральное отверстие подготовленной формы в сборе.

Затем поместите форму на одноразовую чашку Петри и переместите ее в стандартный инкубатор на 20 минут при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом. Переместите всю систему в микроскоп и осмотрите камеру, чтобы убедиться, что стороны коллагеновой формы все еще прямые, что позволяет получить планер диффузионного градиента с системой, все еще находящейся под микроскопом. В первую лунку добавьте 100 микролитров клеточной среды.

Далее добавьте 100 микролитров клеточной среды с нужной концентрацией химиоаттрактанта в лунку с другой стороны матрицы. Отслеживайте миграцию клеток по флуоресцентно меченным микросферам, как описано в сопроводительном текстовом протоколе. Серия изображений, представленная здесь, показывает диффузию рубца, проходящую через коллагеновый гель размером один миллиграмм на миллилитр

В этом примере показан истинный планарный градиент диффузии системы, который также можно ожидать от любых введенных химиоаттрактантов. В показанном здесь примере интенсивность сигнала рубца измерялась с течением времени в местах, обозначенных красными квадратами. Концентрация в каждом из этих мест показана на этом графике в виде отдельной линии, которая при измерении в стационарном состоянии создает линейный градиент концентрации на основе положения в геле.

Эта зависимость остается линейной во всем диапазоне концентраций коллагенового матрикса, что делает эту систему очень полезной для клеточных экспериментов. На этом изображении нейтрофилы, окрашенные в красный цвет, показаны внутри коллагеновой матрицы, разбросанной флуоресцентными зелеными микросферами, которые используются в качестве координат положения. Следующие три изображения показывают направленную миграцию нейтрофила по мере его движения вверх по градиенту химиоаттрактанта, который изображен белой стрелкой.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как создать простую диффузионную камеру для исследования миграции клеток в 3D-коллагеновой матрице.