Выбранный мониторинга реакций масс-спектрометрии для абсолютного белка количественной

Общая цель этой процедуры заключается в использовании жидкостной хроматографии, мониторинга выбранных реакций или L-C-S-R-M для количественной оценки абсолютного содержания белков-мишеней в сложных биологических образцах. После выбора пептидных мишеней синтезируются необработанные внешние пептидные стандарты, которые используются для разработки SRM-анализов с использованием жидкостной хроматографии, масс-спектрометрии или LCM ms. Полученные анализы используются для проведения качественного lc, SRM-анализа подготовленных биологических образцов.

Если обнаружен целевой пептид, полученный из биологического образца, биологические образцы анализируют с помощью количественных анализов lc SRM путем добавления ряда стабильных изотопов внутренних пептидных стандартов. В конечном счете, lc SRM может быть использован для точного количественного определения белков из широкого спектра биологических образцов и для поддержки исследований широкого спектра белковых мишеней. Основное преимущество этой методики перед существующими методами, такими как иммунологические анализы, заключается в том, что разработка анализов происходит относительно быстро и недорого, а полученные анализы поддаются мультиплексированию и не подвержены перекрестной реактивности антител.

Для начала подготовьте стандарты лиофилизированных пептидов, как описано в текстовом протоколе. Затем добавьте 100 микролитров раствора ацетонитрила муравьиной кислоты к каждому М стандартного лиофилизированного пептида, чтобы получить концентрацию пептида 10 микромоляров. Ввергните образцы в вортекс в течение двух минут и примите ванну.

Обрабатывайте их ультразвуком в течение пяти минут, чтобы убедиться в полном растворении пептида. Вытяните растворенные пептиды и сконцентрируйте полученную смесь в вакуумном концентраторе до конечного объема 80 микролитров. Добавьте 20 микролитров ацетилнитрила, чтобы растворить любой осажденный пептид.

Для подготовки стандартов внутренних и внешних пептидов проанализируйте смеси стандартов внешних пептидов в концентрации примерно от одного до 10 пикомолев каждого пептида на инъекцию с помощью дробовой масс-спектрометрии с использованием нанопроточной системы ВЭЖХ, соединенной с тройным четырехкратным масс-спектрометром. Как подробно описано в текстовом протоколе, убедитесь, что каждый прогон LCMS включает в себя 60-минутный линейный градиент, этап регенерации столбца и шаг уравновешивания столбца. Анализируйте полученные данные с помощью базы данных, выполняя поиск по последовательностям стандартов внешних пептидов.

Вручную просмотрите все идентификации пептидов, чтобы убедиться, что все они однозначны, отбросив любые неоднозначные идентификации пептидов. Используйте идентификацию Ms Peptide с помощью дробовика для создания библиотеки спектра с помощью такой программы, как Skyline Line. Подготовьте список переходов lc SRM, используя от трех до 10 наиболее интенсивных переходов на каждый прекурсор-ион.

С помощью полученных переходных списков выполнить lc SRM-анализ смесей внешних пептидов стандарта. Вручную просмотрите полученные данные L-C-S-R-M и удалите все неэффективные анализы. Для подготовки биологических образцов.

Во-первых, соберите клетки, как описано в текстовом протоколе. Добавьте 400 микролитров свежеприготовленного буфера для лизиса мочевины и перемешайте каждый образец с помощью щадящего пипетирования. Переложите каждый образец в двухмиллилитровую пробирку, которая имеет завинчивающуюся крышку с уплотнительным кольцом, содержащую примерно 100 микролитров 0,1 миллиметра диоксида циркония кремнезема, клетки лизуса путем вортексирования образцов в течение пяти минут на полной скорости.

Обрабатывайте образцы ультразвуком в течение 10 минут при комнатной температуре, чтобы способствовать гомогенизации и созреванию белка. Затем проведите анализ концентрации белка в лизатах, например, анализ кислот Бисси для качественного анализа. Приготовьте для 200 мкг аликвот клеточного лизата для серии стабильного изотопного разведения.

Добавьте к образцам ряд разбавления стабильных изотопов эхомолярной смеси внутренних пептидных стандартов. Уменьшите количество остатков цистеина в белке, добавив 0,7 микролитра одного молярного DTT в каждый образец и инкубируя образцы при температуре 60 градусов Цельсия в течение 30 минут. Алкилатируют белковые цистины путем добавления семи микролитров буферного ацетамида ITO в каждый образец и инкубации образцов при комнатной температуре в течение 20 минут в темноте.

Для каждого из образцов добавьте 482 микролитра 100 миллимолярных гектаров, отрегулированных гидроксидом натрия так, чтобы конечная концентрация мочевины составила один моляр. Далее, трижды, перевариваем белки в пептиды. Добавьте восемь микролитров по 0,5 микрограмма на микролитр трипсина класса секвенирования к каждому образцу, содержащему лизат клеток.

Затем инкубируйте образец при температуре 37 градусов Цельсия в течение 18 часов. После инкубации добавьте 440 микролитров 2% объема к объему муравьиной кислоты центрифугируйте все образцы при 21 000 г в течение 20 минут при комнатной температуре, чтобы удалить любые осадки, которые могут засорить твердую фазу картриджа C 18 SPE. Извлеките каждый из натинов SUP с помощью одноразового патрона серии C 18 SPE.

Намочите колонку, внеся один миллилитр буфера В, и уравновесьте ее, дважды внеся один миллилитр буфера А. Продавливайте подвижные фазы через картридж C 18 SPE с помощью плоской поверхности к резиновой колбе и вытяжному коллектору. Нанесите образец и затем промойте картридж одним миллилитром буфера А, дважды элюируйте пептиды, нанеся один миллилитр буфера В. Медленно сконцентрируйте каждый илу в вакуумном концентраторе до конечного объема 100 микролитров, чтобы испарить ацетилнитрил.

Затем добавьте два микролитра, 5% объема к объему муравьиной кислоты в ацетилнитриле в каждый образец. Проанализируйте образцы с использованием качественных L-C-S-R-M, как и раньше. Для количественного анализа L-C-S-R-M был проведен цикл разбавления изотопов каждого биологического образца, который был использован для анализа внешних пептидных стандартов.

Для L-C-S-R-M были выбраны 10 наиболее интенсивных переходов на прекурсор. Затем для анализа внешних пептидных стандартов использовали L-C-S-R-M. Результирующая идентификация пептидов должна быть однозначной.

Качественный L-C-S-R-M анализ биологических образцов обычно приводил к большему количеству фонового сигнала, но большинство пептидных мишеней были уверенно идентифицированы. Количественное определение L-C-S-R-M проводили с использованием внутренних пептидных стандартов, введенных в биологические образцы. Полученные значения обилия белка были согласованы между биологическими репликатами и двумя пептидами-мишенями на белок-мишень.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как разрабатывать и проводить L-C-S-R-M анализы для количественной оценки абсолютного содержания целевых белков в сложных биологических образцах.