Name: Количественное Цитозольные против вакуолярной Сальмонелла В первичных макрофагах дифференциальной проницаемости (Видео) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Узнайте метод количественного определения цитозольных и вакуолярных Salmonella typhimurium в макрофагах костного мозга с помощью дифференциальной пермеабилизации дигитонином и анализа FACS.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Мы хотели бы поблагодарить Mathias S. Дик, Roland Ф. Дрейер и Себастьян Рул для обсуждения. Эта работа была поддержана SNSF профессуру PP00P3_139120 / 1 и Университета Базеля грантового проекта ID2153162 к ПБ

<ol><li>Kumar, Y., Valdivia, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leading+a+sheltered+life%3A+intracellular+pathogens+and+maintenance+of+vacuolar+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Leading a sheltered life: intracellular pathogens and maintenance of vacuolar compartments.</a> Cell Host Microbe. 5, 593-601 (2009).</li>
<li>Chong, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+early+phagosomal+stage+of+Francisella+tularensis+determines+optimal+phagosomal+escape+and+Francisella+pathogenicity+island+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">The early phagosomal stage of Francisella tularensis determines optimal phagosomal escape and Francisella pathogenicity island protein expression.</a> Infect Immun. 76, 5488-5499 (2008).</li>
<li>Mellouk, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shigella+subverts+the+host+recycling+compartment+to+rupture+its+vacuole%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Shigella subverts the host recycling compartment to rupture its vacuole.</a> Cell Host Microbe. 16, 517-530 (2014).</li>
<li>Checroun, C., Wehrly, T. D., Fischer, E. R., Hayes, S. F., Celli, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy-mediated+reentry+of+Francisella+tularensis+into+the+endocytic+compartment+after+cytoplasmic+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Autophagy-mediated reentry of Francisella tularensis into the endocytic compartment after cytoplasmic replication.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 14578-14583 (2006).</li>
<li>Broz, P., Monack, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newly+described+pattern+recognition+receptors+team+up+against+intracellular+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Newly described pattern recognition receptors team up against intracellular pathogens.</a> Nat Rev Immunol. 13, 551-565 (2013).</li>
<li>Hagar, J. A., Powell, D. A., Aachoui, Y., Ernst, R. K., Miao, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+LPS+activates+caspase-11%3A+implications+in+TLR4-independent+endotoxic+shock%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic LPS activates caspase-11: implications in TLR4-independent endotoxic shock.</a> Science. 341, 1250-1253 (2013).</li>
<li>Ogawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escape+of+intracellular+Shigella+from+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Escape of intracellular Shigella from autophagy.</a> Science. 307, 727-731 (2005).</li>
<li>Haraga, A., Ohlson, M. B., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonellae+interplay+with+host+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Salmonellae interplay with host cells.</a> Nat Rev Microbiol. 6, 53-66 (2008).</li>
<li>Birmingham, C. L., Smith, A. C., Bakowski, M. A., Yoshimori, T., Brumell, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+controls+Salmonella+infection+in+response+to+damage+to+the+Salmonella-containing+vacuole%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Autophagy controls Salmonella infection in response to damage to the Salmonella-containing vacuole.</a> J Biol Chem. 281, 11374-11383 (2006).</li>
<li>Malik-Kale, P., Winfree, S., Steele-Mortimer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bimodal+lifestyle+of+intracellular+Salmonella+in+epithelial+cells%3A+replication+in+the+cytosol+obscures+defects+in+vacuolar+replication%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The bimodal lifestyle of intracellular Salmonella in epithelial cells: replication in the cytosol obscures defects in vacuolar replication.</a> PLoS One. 7, e38732(2012).</li>
<li>Zhao, Y. O., Khaminets, A., Hunn, J. P., Howard, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+Toxoplasma+gondii+parasitophorous+vacuole+by+IFNgamma-inducible+immunity-related+GTPases+%28IRG+proteins%29+triggers+necrotic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Disruption of the Toxoplasma gondii parasitophorous vacuole by IFNgamma-inducible immunity-related GTPases (IRG proteins) triggers necrotic cell death.</a> PLoS Pathog. 5, e1000288(2009).</li>
<li>Meunier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-11+activation+requires+lysis+of+pathogen-containing+vacuoles+by+IFN-induced+GTPases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Caspase-11 activation requires lysis of pathogen-containing vacuoles by IFN-induced GTPases.</a> Nature. 509, 366-370 (2014).</li>
<li>Yamamoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cluster+of+interferon-gamma-inducible+p65+GTPases+plays+a+critical+role+in+host+defense+against+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">A cluster of interferon-gamma-inducible p65 GTPases plays a critical role in host defense against Toxoplasma gondii.</a> Immunity. 37, 302-313 (2012).</li>
<li>Degrandi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+guanylate+binding+protein+2+%28mGBP2%29+controls+Toxoplasma+gondii+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Murine guanylate binding protein 2 (mGBP2) controls Toxoplasma gondii replication.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 294-299 (2013).</li>
<li>Mariathasan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+activation+of+the+inflammasome+by+caspase-1+adaptors+ASC+and+Ipaf%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Differential activation of the inflammasome by caspase-1 adaptors ASC and Ipaf.</a> Nature. 430, 213-218 (2004).</li>
<li>Knodler, L. A., Nair, V., Steele-Mortimer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+cytosolic+Salmonella+in+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of cytosolic Salmonella in epithelial cells.</a> PLoS One. 9, e84681(2014).</li>
<li>Ng, H., Smith, D. J., Nagley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+flow+cytometry+to+determine+differential+redistribution+of+cytochrome+c+and+Smac%2FDIABLO+from+mitochondria+during+cell+death+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Application of flow cytometry to determine differential redistribution of cytochrome c and Smac/DIABLO from mitochondria during cell death signaling.</a> PLoS One. 7, e42298(2012).</li>
<li>Krawczyk, E., Suprynowicz, F. A., Sudarshan, S. R., Schlegel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+orientation+of+the+human+papillomavirus+type+16+E5+oncoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Membrane orientation of the human papillomavirus type 16 E5 oncoprotein.</a> J Virol. 84, 1696-1703 (2010).</li>
<li>Keller, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+measurements+of+vacuolar+rupture+caused+by+intracellular+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Single cell measurements of vacuolar rupture caused by intracellular pathogens.</a> J Vis Exp. , e50116(2013).</li>
</ol>

Нам нечего раскрывать.

Дифференциальный пермеабилизации это легко и надежный метод для анализа и количественной оценки субклеточную распределение бактериальных патогенов между вакуолярных отсеков и цитозоле. Анализ же успешно используется такими бактериями, как Francisella novicida 2,4 и шигеллы Флекснера 12. Тем не менее, поскольку многие внутриклеточные патогенов изменять или модифицировать хозяев эндомембранную структуры, надежность дигитониновым проницаемости должны быть определены на индивидуальной...

Внутриклеточные бактериальные патогены репликации либо непосредственно в цитозоль клетки-хозяина, или в специализированных вакуолярных отсеков 1. Во время начальной стадии инфекции большинство патогенных микроорганизмов получают усвоены либо фагоцитоза специализированных клеток (например, макрофагов), либо активно продвигает свою собственную поглощение в не-фагоцитирующих клеток. В фагоцитирующих клеток, как правило, фагосомы сливается с лизосомы сформировать деструкции отсек, где фагоцитированы частицы переваренной. Специализированный цитозольные бактерии, такие как Francisella novicida или Shigella Флекснера, бежать деградации phagosomal, вызывая разрыв фагосомы и впоследствии бежать в цитозоле 2,3. Это требует вирулентности-ассоциированных механизм таких как Francisella острова патогенности (FPI) или Shigella Флекснера T3SS, который впрыскивает эффекторные белки, которые способствуют вакуолярной разрыв 2-4. Особенности клетка-хозяин цитозольныеКоличество сохраняемых распознающих рецепторов, которые обычно признают наличие возбудителей и вызывают иммунной сигнализации 5. Кроме того, xenophagy, антимикробное форма аутофагии может ухудшить бактерии, которые попадают в цитозоль. Цитозольные бактерии, как правило, хорошо приспособлены к притупить или обойти эти ответы с помощью различных стратегий. Например, Francisella изменяет свои LPS, чтобы избежать признания хоста и шигеллы предотвращает набор аутофагии с помощью секретируемых белков эффекторные 6,7. Другая стратегия, чтобы избежать деградации лизосомами используется в модели вакуолярный возбудителя Salmonella enterica серовар Typhimurium, после называют Salmonella Typhimurium. Сальмонелла использует T3SS чтобы придать эффекторы, что переделывать первоначальный фагосомы в его внутриклеточной ниши, сальмонеллы -содержащего вакуоли (ПЗК) 8,9. Непрерывная манипуляции принимающих путей являетсянеобходимо сохранить эту вакуоль по вербовке липидов и других питательных веществ в вакуоли. Действительно, SIFA мутант Salmonella не удается поддерживать стабильность вакуолярной, и входит в цитозоле клеток-хозяев в течение нескольких часов после заражения, что приводит к активации врожденного иммунитета путей и аутофагии набора 8. Вакуолярной побег Salmonella варьируется в зависимости от типа клеток, что является исследования, и несколько отчетов показали, что в эпителиальных клетках даже БТ Сальмонелла может избежать SCV и hyperreplicate в цитозоле 10. Последние отчеты показывают, что врожденная иммунная обнаружения патогенов вакуолярных также зависит от способности хозяина, чтобы признать и дестабилизировать патогенов, содержащий вакуоли (PCVs) 11-14. Учитывая, что оба хоста или бактерии генотип может влиять на распределение внутриклеточных бактерий между вакуолярную и цитозольной отсека, необходимо определить число вакуоли VS.цитозольные бактерии. Так, в большинстве экспериментальных установок клетки-хозяева инфицированы более чем одной бактерии, и в дальнейшем может питать несколько бактерий в различных субклеточных отсеков, метод необходим, что позволяет количественной на уровне отдельных бактерий. Дифференциальный пермеабилизации (также известный как защита phagosomal анализа) обеспечивает эту резолюцию 2,4,10,12. Анализ основан на селективной проницаемости мембраны клетки-хозяина плазмы с моющим средством дигитонин, что оставляет нетронутыми вакуоли мембраны и, таким образом, позволяет избирательно окрашивание цитоплазмы бактерии с антителами. Здесь мы предлагаем два протокола для количественного определения цитозольного и вакуолярной Salmonella Typhimurium, используя дифференциальный пермеабилизации. Принцип этого метода описан в рисунке 1: костный мозг, полученные макрофаги (BMDMs) заражены стационарной фазы mCherry-выражения сальмонеллы. Стационарная фаза сальмонеллы нужно тО быть использованы, потому что они подавляют экспрессию SPI-1 T3SS, чья деятельность в противном случае будут признаны инфламмасома NLRC4 и вызывают быструю смерть клеток (pyroptosis) в BMDMs 15. После инфекции клетки промывают и обрабатывают 50 мкг / мл дигитонина в течение 1 минуты. Клетки снова промывают сразу и инкубировали с анти-антител сальмонеллы, соединенных с FITC, чтобы отметить бактерии с доступом в цитозоль. После дополнительного этапа промывки клетки лизируют и процент mCherry + (вакуоли) и FITC + / + mCherry (цитозольного) бактерий определяется FACS. Мы также сообщают об адаптации этого метода, которые могут быть использованы, если нет флуоресцентные штаммы, экспрессирующие белок не доступны (рисунок 2). Дополнительные шаги вводятся после FITC маркировки, в котором клетки фиксированной и полностью проницаемыми. После этого все бактерии окрашивали анти Salmonella антител и соответствующих вторичных антител. Detотражения затем сделать с помощью микроскопии вместо анализа FACS.

<table><tbody><tr><td>Дигитонин</td><td>Sigma</td><td>D5628 50</td><td>&mu; г/мл</td></tr><tr><td>PFA</td><td>mpbio</td><td>219998380</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>Ацетат калия</td><td>Sigma</td><td>791733</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>антисальмонелла CSA-1-FITC</td><td>KPL</td><td>01-91-99-MG</td><td>1/500</td></tr><tr><td>антисальмонелла CSA-1</td><td>KPL</td><td>02-91-99-MG</td><td>1/500</td></tr><tr><td>антикальнексин</td><td>Enzo Lifesciences</td><td>SPA-860D</td><td>1/100</td></tr><tr><td>анти-PDI</td><td>Enzo Lifesciences</td><td>SPA-890</td><td>1/100</td></tr><tr><td>сапонин</td><td>Sigma</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>Монтажная среда Vectashield</td><td>Vectorlabs</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Anti Rabbit антитела-488</td><td>Молекулярные Зонды</td><td>A-11070</td><td>1/500</td></tr><tr><td>глицин</td><td>Sigma</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>гентамицин</td><td>Life Technologies</td><td>15710-49</td><td>100 &mu; г/мл и 10 мкм; г/мл</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Promega</td><td>H5141</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>20012-019</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Amimed</td><td>5-13K00-H</td><td></td></tr><tr><td>LSM700 Конфокальный микроскоп</td><td>Zeiss</td><td></td><td>визуализация сделана с 63X</td></tr><tr><td>FACS Fortessa</td><td>BD технологии</td><td></td><td>обнаружения mCherry 610 нм</td></tr><tr>Технологии <td></td><td>обнаружения FACS Fortessa</td><td>BD</td><td>FITC 530 нм</td></tr></tbody></table>

Количественное Цитозольные против вакуолярной<em&gt; Сальмонелла</em&gt; В первичных макрофагах дифференциальной проницаемости

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Внутриклеточные бактериальные патогены могут размножаться в цитоплазме или в специализированных патогенов, содержащих вакуолей (PCVs). Чтобы добраться до цитозоль, бактерии, как Shigella Флекснера и Francisella novicida нужно вызвать разрыв фагосомы. В отличие, сальмонелла Typhimurium реплицируется в вакуолярной купе, известный как Salmonella -содержащего вакуоли (SCV). Однако некоторые мутанты Salmonella не поддерживать SCV целостность и, таким образом, выпущен в цитозоль. Процент цитозольного против вакуолярных бактерий на уровне отдельных бактерий может быть измерена дифференциальной проницаемости, также известный как фагосомы-анализ защиты. Подход делает использование имущества моющего средства дигитонина селективно связываться холестерина. Поскольку плазматической мембраны содержит больше холестерина, чем других клеточных мембран, дигитонин может быть использован, чтобы селективно проницаемыми плазматическую мембрану, оставляя внутриклеточных мембранбез изменений. Короче говоря, после инфицирования патогеном, экспрессирующих флуоресцентный белок-маркер (например mCherry среди прочих), плазматической мембраны клеток-хозяев в проницаемыми с короткой инкубации в дигитонин, содержащей буфер. Затем клетки промывали и инкубировали с первичным антителом (соединенный с флуорофора выбора), направленный против бактерии выбора (например, анти-Salmonella -FITC) и снова промывают. Если немаркированных бактерии используется дополнительная стадия может быть сделано, в котором все мембраны проницаемыми и все бактерии окрашивали с соответствующим антителом. После окрашивания, процент вакуолярных и цитоплазмы бактерий может быть количественно FACS или микроскопа путем подсчета одинарные или двойные-положительных событий. Здесь мы предлагаем экспериментальные детали для использования этой техники с бактерией Salmonella Typhimurium. Преимущество такого анализа является то, что, в отличие от других анализа, он обеспечивает количественную на уровне одного bacteРИА, и если анализировали с помощью микроскопии обеспечивает точное число цитозольного и вакуолярных бактерий в данной клетке.

На рисунке 1 и 2 приведены схемы дигитонинового анализа, описанные в протокол 1 и протокол 2, иллюстрирующий важные шаги в протоколе и полученные результаты. Рисунок 3 показывает типичные FACS результаты. Положительные и отрицательные элементы управления используются для установки ворот для mCherry + / FITC- бактерий (Salmonella) вакуолярный и mCherry + / FITC + бактерий (Salmonella) цитозольный. На основании этих воротах процент цитозольных и вакуолей бактерии могут быть ...

Мы описываем количественное определение цитозольного и вакуолярного Salmonella typhimurium в макрофагах, полученных из костного мозга, с использованием дифференциальной пермеабилизации дигитонина.

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

Общая цель следующего эксперимента заключается в определении процента цитозольных и вакуолярных Salmonella Typhimurium в инфицированных макрофагах, полученных из костного мозга. Это достигается путем инфицирования макрофагов Salmonella Typhimurium, экспрессирующими M-cherry. На втором этапе клетки обрабатывают детергентом тонином, который делает проницаемой плазматическую мембрану, но не вакуолярные мембраны.Затем клетки окрашивают антителами к Salmonella, конъюгированными с флуорофором Zi. Для маркировки цитозольной Salmonella ty erum результаты представляют в виде процента цитозольных бактерий от общего числа бактерий, определенного с помощью метода сортировки клеток с флуоресцентной активацией (FACS). Эти методы позволяют ответить на ключевые вопросы в области взаимодействия патогенов, например: реплицируется ли внутриклеточный патоген в вакуоли или в цитозоле. За сутки до инфицирования инокулируют бактериальный штамм в 3 мл среды Luria-Bertani с добавлением стрептомицина и ампициллина в шейкере при 37 °C на ночь для обеспечения однородности условий. В лунки 24-луночного планшета, которые будут использоваться в качестве контролей для посева клеток перед инфицированием, помещают покровные стекла. Высевают макрофаги костного мозга дикого типа (BMDMs) с плотностью 0,125 млн клеток на лунку в 1 мл среды для первичных макрофагов, затем инкубируют клетки в инкубаторе при 37 °C и 5% CO2 в течение ночи.На следующий день. Определите концентрацию salmonella в ночной культуре, измерив оптическую плотность при 600 нанометрах или OD 600 разведенной культуры относительно фосфатно-солевого буферного раствора. Это гарантирует, что измерение OD 600 проводится в линейном диапазоне спектрофотометра.Рассчитайте концентрацию salmonella на миллилитр; значение OD 600, равное 1, соответствует 1 миллиарду бактерий. Разведите бактерии в среде для макрофагов до достижения концентрации salmonella 1,25 миллиона клеток на миллилитр для инфицирования клеток salmonella. Удалите среду из B MDMs.Добавьте один миллилитр среды для макрофагов в лунки неинфицированного контроля: с B1 по B3 и с C1 по C3. Затем добавьте один миллилитр суспензии salmonella в лунки с A1 по A5, чтобы достичь множественности заражения 10 бактерий на клетку. Центрифугируйте планшет в течение 15 минут при 300 ×g и 37 °C для синхронизации инфекции, после чего перенесите планшет в инкубатор при 37 °C и 5% CO2 на один час после заражения. Извлеките планшет из инкубатора и добавьте 0,1 миллилитра среды для макрофагов, содержащей гентамицин, для уничтожения внеклеточных бактерий.Добавьте гентамицин во все лунки, включая неинфицированные контроли, чтобы обеспечить одинаковую обработку всех клеток. Затем через два часа после инфицирования перенесите планшет в инкубатор при 37 °C и 5% CO₂. Извлеките планшет из инкубатора и промойте все лунки дважды, используя по 1 мл предварительно прогретого модифицированного среды Игла (DMEM).Замените DMEM на предварительно нагретую среду для макрофагов, содержащую гентамицин, чтобы предотвратить рост любых оставшихся внеклеточных бактерий, перед возвращением планшета в инкубатор непосредственно перед желаемым моментом анализа. Приготовьте свежие растворы буфера KHM, буфера KHM с дигитонином и буфера KHM с сапонином. В дополнение к растворам антител, описанным в текстовом протоколе для проведения пермеабилизации клеток, извлеките планшет из инкубатора и трижды промойте лунки 0,5 миллилитрами предварительно нагретого буфера KHM.Затем удалите буфер KHM и добавьте 0,25 мл обычного буфера KHM в лунки A4, B1 и C1; буфер KHM с дигитонином — в лунки с A1 по A3, B2 и C2; и буфер KHM с сапонином — в лунки A5, B3 и C3. Инкубируйте в течение ровно одной минуты при комнатной температуре, после чего немедленно промойте все лунки три раза 0,5 мл ПРЕРЕГРЕТОГО буфера KHM. Наконец, удалите буфер KHM и добавьте растворы первичных антител в соответствующие лунки, после чего инкубируйте планшет в течение 15 минут при 37 °C и 5% CO2. После инкубации промойте клетки один раз 1 мл PBS (для инфицированных клеток в лунках с A1 по A5).Подготовьте образцы к анализу методом FACS, промыв клетки трижды в PBS. Затем добавьте 0,5 мл ледяного PBS, содержащего 0,1% Triton. После этого перенесите клеточную суспензию в пробирку для FACS объемом пять мл с крышкой-фильтром для разрушения клеточных агрегатов, сохраняя образцы на льду.Проанализируйте образцы на проточной цитометрической системе, используя полностью проницаемые контроли. Установите гейт для общей популяции бактерий на основании прямого и бокового светорассеяния, а также сигнала mCherry. Затем проанализируйте сигнал fitz в общей популяции бактерий, используя полностью проницаемые и непроницаемые контроли, чтобы установить гейты для цитозольных и вакуолярных бактерий.Проанализируйте образцы и определите процентное соотношение цитозольных и вакуолярных бактерий с помощью программного обеспечения FlowJo. Согласно протоколу производителя для неинфицированных контролей проницаемости в лунках B1–B3 и C1–C3, подготовьте образцы для микроскопии: удалите PBS и добавьте 250 мкл 4% параформальдегида в PBS, затем инкубируйте в течение 10 минут при 37 °C. Промойте лунки дважды 1 мл PBS и добавьте 250 мкл 0,1 М глицина в PBS на 10 минут для гашения фиксатора, после чего промойте лунки дважды 1 мл PBS перед окрашиванием вторичными антителами.Окрашивайте контроли проницаемости в течение одного часа при комнатной температуре с использованием соответствующих вторичных антител, конъюгированных с флуорофорами, в PBS, дополненном 0,1% сапонина и 3% BSA. Для полной пермеабилизации клеток промойте покровные стекла трижды одним миллилитром PBS и зафиксируйте покровные стекла для анализа в фиксирующем средстве с DAPI.Проанализируйте покровные стекла с контрольными образцами при увеличении 40 x или 63 x с помощью конфокального флуоресцентного микроскопа. Здесь представлены типичные результаты. Результаты положительного и отрицательного контролей используются для установления гейтов для m cherry-положительных и FITC-положительных бактерий (цитозольная salmonella), а также для m cherry-положительных и FITC-отрицательных бактерий (вакуолярная salmonella).На основании этих гейтов в экспериментальных образцах определяется процент цитозольных и вакуолярных бактерий. В данном примере mCherry-положительный дикий тип Salmonella typhimurium сравнивается с мутантом с делецией CA. Здесь показано окрашивание на calnexin и PD-1, полученное в контролях проницаемости с обработкой digitonin или saponin; поскольку calnexin является белком мембраны ЭР, окрашивание на calnexin наблюдается по всему цитозолю и вокруг ядра как в клетках, пермелизованных digitonin, так и в клетках, пермелизованных saponin. В контролях с digitonin окрашивание на PD-1 не наблюдается.Хотя окрашивание может наблюдаться в клетках, обработанных сазином и пермеатизаторами, здесь представлен результат окрашивания антителами к Salmonella в клетках, пермеатизированных тонином. Общая популяция бактерий выделена красным цветом, а цитозольные бактерии — зеленым.Популяция, положительная по E, представляет собой сальмонеллы, имеющие доступ к цитозолю. В то время как популяция, отрицательная по fite, состоит из бактерий, находящихся в неповрежденной сальмонелла-содержащей вакуоли (SCV) и, следовательно, защищенных от маркировки сальмонеллы FSE. Здесь дикий тип сальмонеллы сравнивается со штаммом-мутантом с делецией CFE. Поскольку CA необходима сальмонелле для поддержания целостности SCV, процент сальмонелл увеличивается. После просмотра этого видео вы должны хорошо понять, как определить процент вакуолярных и цитозольных бактерий.

quantification-cytosolic-vs-vacuolar-salmonella-primary-macrophages

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Иммунология и инфекции

В этой статье мы опишем метод с использованием нескольких спектральных изображений проточной цитометрии для количественного определения интернализации polyanhydride наночастиц или бактерий RAW 264.7 клеток.

Анализируя сотовой Интернализация наночастиц и бактерий нескольких спектральных изображений проточной цитометрии

Это видео демонстрирует анализ для количественной оценки внутриклеточного роста паразитов в макрофагах, полученных из костного мозга (BMM). Клетки макрофагов инфицированы подвижными и неподвижными инвазивными стадиями Leishmania, метациклическими промастиготами и амастиготами соответственно. Паразиты проникают в макрофаги, интернализуются в паразитофорную вакуоль и размножаются внутри. Внутриклеточный рост паразита количественно определяют с помощью микроскопа после флуоресцентного окрашивания...

Анализ in vitro для количественной оценки внутриклеточного роста паразита в макрофагах

Это видео демонстрирует анализ количественного определения цитозольной и вакуолярной Salmonella typhimurium внутри макрофагов, полученных из костного мозга, с использованием дифференциальной пермеабилизации. Макрофаги инфицированы флуоресцентной сальмонеллой, экспрессирующей белки, которая интернализуется внутри специализированной вакуолярной структуры, называемой сальмонеллосодержащей вакуолью или SCV. Подмножество бактерий покидает SCV и проникает в цитозоль. Богатая холестерином...

Анализ для количественного определения цитозольной и вакуолярной сальмонеллы в инфицированных первичных макрофагах

Мы опишем метод для отслеживания endomembrane вызванной разрывом внутриклеточных...

Единичных измерений Сотовые вакуолярных разрыв под действием внутриклеточных патогенов

Была разработана с высокой пропускной анализ, чтобы в пробирке фенотипа сальмонеллами или другой бактериальной ассоциации, вторжения и репликации в фагоцитов с высокой пропускной способностью. Метод был использован для оценки Salmonella ген нокаут мутантных штаммов для их вовлеченности в хозяин-патоген взаимодействий.

Высокая пропускная Анализ фенотипу Salmonella enterica Typhimurium Ассоциация, Нашествие, и репликации в макрофагах

Эта статья описывает методы синтеза и флуоресцентных меток наночастиц (NPS). АПЛ были применены в импульсно-погони экспериментов для обозначения эндо-лизосомальное систему эукариотических клеток. Манипуляции с эндо-лизосомальных системы по деятельности внутриклеточного патогена Сальмонелла энтерика последовали живых клеток изображений и количественно.

Применение люминесцентных наночастиц по изучению ремоделирования Endo-лизосом Системе внутриклеточных бактерий

Мы опишем здесь простой и быстрый метод для изоляции Salmonella typhimurium-содержащих phagosomes от макрофагов, покрывая бактерий с биотина и стрептавидина.

Изоляция Salmonella typhimurium-содержащих Phagosomes от макрофагов

Все патогенных видов Leishmania проживают и репликацию внутри макрофагов их позвоночных хозяев. Здесь мы представляем протокол заразить мышиных макрофаги костного мозга, полученных в культуре с лейшманий, следуют точную количественную оценку роста внутриклеточных кинетики. Этот метод полезен для изучения отдельных факторов, влияющих на взаимодействие хост возбудителя и лейшмании вирулентности.

Количественная оценка внутриклеточных роста внутри макрофагов является быстрый и надежный метод оценки вирулентности лейшмании паразитов

Efferocytosis, фагоцитарной удаление apoptotic клеток, необходимых для поддержания гомеостаза и облегчается рецепторов и сигнальных путей, которые позволяют для распознавания, поглощения и интернализация apoptotic клеток. Здесь мы представляем протокол микроскопии флуоресцирования для количественной оценки efferocytosis и активность efferocytic сигнальные пути.

Количественная оценка Efferocytosis по микроскопии флуоресцирования одноклеточного

Здесь мы представляем протокол для оценки мыши фагоцитоза перитонеальных макрофагов с помощью расширенной зеленого флуоресценции белков выражая Escherichia coli.

С помощью усиленной зеленый флуоресценции белков выражая Escherichia Coli оценить мыши перитонеальных макрофагов фагоцитоз

Сальмонелла вторгается и реплицируется внутри эпителиальных клеток кишечника как в вакуолях, специфичных для сальмонеллы, так и свободно в цитозоле (гиперрепликация). Здесь описан высокопроизводительный протокол на основе флуоресцентной микроскопии для количественной оценки внутриклеточных фенотипов сальмонеллы с помощью двух дополнительных анализов изображений через ImageJ, достигая одноклеточного разрешения и оценки.

Автоматизированный анализ внутриклеточных фенотипов сальмонеллы с помощью ImageJ

Узнайте метод количественного определения цитозольных и вакуолярных Salmonella typhimurium в макрофагах костного мозга с помощью дифференциальной пермеабилизации дигитонином и анализа FACS.

Количественное Цитозольные против вакуолярной

Больше видео