Определение жирных кислот и окисления Липогенез в первичных гепатоцитов мышей

Общая цель данной процедуры — оценка метаболизма жирных кислот в первичных гепатоцитах мыши. Для этого сначала проводят перфузию печени мыши средой для дигестии, извлекают орган, после чего изолируют гепатоциты. На втором этапе гепатоциты культивируют на планшетах, покрытых коллагеном.

Затем гепатоциты подвергают воздействию тестируемых экспериментальных факторов. Заключительным этапом является инкубация клеток в присутствии радиоактивно меченного субстрата. В итоге для демонстрации влияния различных фармакологических или генетических воздействий на окисление жирных кислот или липогенез в первичных гепатоцитах используется жидкостный сцинтилляционный анализ.

Данный метод может помочь ответить на несколько ключевых вопросов в области метаболизма и диабета, включая то, как конкретные фармакологические и генетические вмешательства влияют на биологию гепатоцитов. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение по двум причинам. Во-первых, трудно создать специфические условия перфузии, влияющие на жизнеспособность гепатоцитов, а во-вторых, необходимо количественное определение выделяемого диоксида углерода.

Поведение газов неочевидно. Эту процедуру продемонстрирует Том Эки, аспирант моей лаборатории. Подготовьте перистальтический насос, поместив один конец стерильной трубки в предварительно нагретую среду для перфузии печени, а другой — в контейнер для отходов.

Запустите насос до тех пор, пока вся длина трубки не будет заполнена средой. После забивания интересующей мыши обильно обработайте живот животного распылителем с 70% ethanol. Затем с помощью ножниц с тупым концом сделайте срединный разрез кожи по всей длине живота и раздвиньте края кожи латерально.

Сделайте аналогичный разрез брюшины, чтобы обнажить внутренние органы. С помощью тупого инструмента осторожно отодвиньте кишечник. Чтобы обнажить сосуды брюшной полости, найдите нижнюю полую вену и наложите шов под кровеносным сосудом дистальнее почечной вены, дистальнее шва.

Введите иглу и катетер в нижнюю полую вену и продвиньте их за шов. Не вынимая иглу, завяжите нить шва вокруг катетера для его фиксации, после чего осторожно извлеките иглу. При правильном выполнении кровь будет поступать через катетер при использовании пипетки.

Заполните оставшуюся часть катетера перфузионной средой, убедившись в отсутствии пузырьков воздуха. Затем с большой осторожностью подсоедините трубку к катетеру. Далее аккуратно проколите диафрагму остроконечными ножницами и сделайте боковой разрез, чтобы открыть доступ к плевральной полости.

Осторожно, избегая повреждения желчного пузыря и сосудов плевры, наложите булдог-зажим на нижнюю полую вену в грудной части, проксимальнее печеночной вены. Затем перережьте воротную вену и включите насос, установив скорость потока от 3 до 4 мл/мин. Проводите перфузию печени средой для перфузии печени в течение 5 минут, используя примерно 20 мл перфузионной среды.

В течение этого времени наблюдайте за немедленным изменением цвета печени с красного на серо-бежевый. Если участки печени остаются красными, это указывает на плохую перфузию, и вероятность успешной изоляции значительно снижается. По прошествии пяти минут перфузии остановите насос и переведите трубку в среду для переваривания печени.

Снова включите насос и перфузируйте печень в течение еще 10–15 минут. Скорость потока должна составлять от 3 до 4 мл/мин до полного расхода среды. По завершении перфузии остановите насос.

Печень должна иметь розоватый оттенок и выглядеть несколько увеличенной. На этом этапе удалите печень путем аккуратного диссекирования. Перенесите её в чашку для культивирования тканей диаметром 10 сантиметров и удалите желчный пузырь.

Затем добавьте 10 мл среды для посева к печени и начните осторожно соскребать ткань печени скальпелем. Чтобы выделить гепатоциты, профильтруйте суспензию через клеточный фильтр с размером пор 100 мкм и перенесите ее в коническую пробирку объемом 50 мл. Промойте чашку еще 10 мл среды для посева и соберите жидкость в коническую пробирку объемом 50 мл.

Затем осадите клетки при температуре four degrees Celsius, центрифугируя в течение five minutes при 350 Gs, аспирируйте среду и ресуспендируйте осадок клеток в 10 milliliters среды для посева. Далее добавьте 10 milliliters 90% коллоидного кремнезема, покрытого поливинилпирролидоном, осторожно перемешайте, а затем снова осадите клетки прежним способом. После центрифугирования аспирируйте слой погибших клеток, плавающих на поверхности смеси.

Затем дважды промойте осадок живых клеток 20 миллилитрами plating medium. Ресуспендируйте конечный осадок клеток в 10 миллилитрах plating medium и подсчитайте количество клеток с помощью гемоцитометра. Поместите по 90 000 клеток в каждую лунку 24-луночных культуральных планшетов, покрытых коллагеном. Инкубируйте планшеты при 37 °C и 5% CO2 в течение двух часов, за 16–20 часов до начала анализа.

Дважды промойте клетки теплым PBS и перенесите их в бессывороточную среду для голодания с добавлением 20 nanomoles глюкагона. Инкубируйте клетки в течение ночи при 37 °C и 5% carbon dioxide перед проведением анализа на следующее утро.

Приготовьте среду для предварительной инкубации, затем замените её на среду для сывороточного голодания. Используйте соответствующую среду для предварительной инкубации. Инкубируйте клетки в этой смеси при 37 °C и 5% CO2 в течение двух часов.

Высушите 0,5 мКи за лунку пальмитата C 14 путем выпаривания этанольного растворителя под током азота. Примерно за 15 минут до окончания инкубации resuspended пальмитат C 14 из расчета 12,5 мкл на мКи в 0,1 н. гидроксиде натрия. Инкубируйте смесь при 70 °C в течение 10 минут. Затем добавьте три объема теплой среды для преинкубации и перемешайте, аккуратно набирая и вытесняя жидкость пипеткой.

В каждую лунку добавьте по 25 µL разведенной смеси C 14 пальмитата, осторожно покачивая планшет, и инкубируйте при 37 °C в течение 90 минут. Это планшет для анализа. Во время инкубации снимите крышку со стерильного 24-луночного планшета и поместите в дно каждой лунки кусочек фильтровальной бумаги размером 2 см на 2 см. Затем накройте планшет куском парафильма размером 4 дюйма на 7 дюймов, используя большой прямоугольный предмет, например, коробку с наконечниками для микропипетки.

Протрите парафином лунки, чтобы проделать отверстия в парафиновом слое в местах расположения лунок и создать герметичный слой на остальной части планшета. Затем удалите проделанные отверстия в парафине. За 10 минут до окончания инкубации, прикрыв лунки, добавьте 200 µL 3N гидроксида натрия в каждую лунку планшета с фильтровальной бумагой, убедившись, что фильтровальная бумага полностью впитала жидкость.

По окончании инкубации подвергните планшет для анализа мгновенной заморозке в жидком азоте. Затем добавьте по 100 µl 70% перхлорной кислоты в каждую лунку планшета. Сразу накройте планшет фильтровальной бумагой и поместите его на орбитальный шейкер.

Инкубируйте планшеты на орбитальном шейкере со скоростью 80 RPM при комнатной температуре в течение двух часов. Затем измерьте долю диоксида углерода, перенеся квадраты фильтровальной бумаги в четыре миллилитра жидкого сцинтилляционного раствора в сцинтилляционные виалы, и измерьте сигнал C 14 на сцинтилляционном счетчике для количественного определения кислоторастворимого материала. Перенесите 400 µL среды в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл, центрифугируйте на максимальной скорости в течение 10 минут, а затем добавьте 100 µL полученного супернатанта к 500 µL смеси хлороформа и метанола в соотношении два к одному.

Кратковременно перемешайте смесь на вортексе, затем добавьте к ней 250 µL воды и снова перемешайте на вортексе. Снова центрифугируйте образцы в течение 10 минут при 1000 ×g. Затем перенесите 200 µL верхней фазы в сцинтилляционный флакон, содержащий 4 мл жидкого сцинтилляционного раствора, и измерьте сигнал C 14 после голодания клеток в сыворотке. Переведите клетки на среду для липогенеза.

Добавьте любые интересующие соединения для тестирования, затем инкубируйте клетки при 37 °C и 5% CO2 в течение двух часов. После завершения инкубации дважды промойте клетки раствором PBS, затем лизируйте клетки, добавив 120 µL 0,1 н. соляной кислоты. Соскребите содержимое каждой лунки для высвобождения лизата, после чего перенесите 100 µL лизата в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.

Затем в каждую пробирку добавьте 500 µL смеси хлороформа и метанола в соотношении два к одному. Кратковременно перемешайте на вортексе, затем инкубируйте при комнатной температуре в течение пяти минут. После инкубации добавьте 250 µL воды, перемешайте на вортексе и инкубируйте образец еще пять минут при комнатной температуре.

Затем центрифугируйте образцы в течение 10 минут при 3000 Gs. Осторожно перенесите нижнюю фазу разделенной жидкости в сцинтилляционный флакон, содержащий четыре миллилитра жидкого сцинтилляционного раствора, и измерьте активность трития с помощью сцинтилляционного счетчика. Данная процедура обычно позволяет выделить от 10 до 30 миллионов гепатоцитов от одной мыши. После инкубации в течение ночи здоровые клетки приобретают гексагональную форму, причем многие из них будут иметь ядра.

Нездоровые культуры часто содержат грануляты или блеббы, что указывает на гибель клеток. Здесь представлены результаты анализа окисления жирных кислот, в котором воздействие F-C-C-P-A (стимулятора клеточного дыхания) и олигомицина (ингибитора дыхания) сравнивали с контролем (растворителем) для измерения полного окисления. Рассчитывается соотношение диоксида углерода к кислоторастворимому материалу.

Вещества, стимулирующие клеточное дыхание, такие как FCCP, сместят это соотношение в сторону диоксида углерода, что указывает на усиление окисления через цикл TCA. Ингибиторы дыхательной цепи при измерении приведут к общему снижению окисления. Что касается липоактивности, соединения, усиливающие окисление жирных кислот, такие как FCCP, или снижающие синтез ATP, такие как олигомицин, уменьшат липоактивность в культивируемых гепатоцитах по сравнению с контролем (плацебо). При выполнении данной процедуры важно обеспечить полное и своевременное проведение перфузии после умерщвления животного.

Кроме того, при проведении анализа окисления жирных кислот полное замораживание среды имеет решающее значение для воспроизводимых измерений содержания углекислого газа. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как выделять первичные гепатоциты, а также использовать эти клетки для анализа окисления жирных кислот и липогенеза in vitro.