Селективный Истощение микроглии от мозжечка ЗК культур, используя L-лейцина

Микроглия может влиять на нейроны и другие глии в культуре с помощью различных неклеточных автономных механизмов. В этой статье мы представляем протокол селективного истощения микроглии из первичных нейронных культур. Этот метод имеет потенциал для выяснения роли микроглиально-нейронных взаимодействий с последствиями для нейродегенеративных состояний, где нейровоспаление является отличительной чертой.

Общая цель этой процедуры заключается в избирательном удалении микроглиальных клеток из культур гранулярных клеток селла. Это достигается путем предварительного культивирования популяции cgc и хранения их в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия с 6% углекислого газа. Вторым шагом является получение раствора LME в среде MEM с получением конечной концентрации 150 миллимолярных LME.

Следующую половину МЭМ-среды из культур CGC удаляют и оставляют в инкубаторе, а затем культуры CGC заменяют равным объемом среды LME, содержащей MEM, и помещают в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия с 6% углекислого газа на один час. Заключительным этапом является двукратная промывка культур CGC свежим предварительным прогреванием. MEM средний.

Замените задержанную питательную среду таким же объемом свежей, среды, а затем верните клетки в инкубатор на 24 часа перед любой дальнейшей обработкой. В конечном счете, иммунохимия и флуоресцентная микроскопия используются для того, чтобы показать специфическое истощение клеток микроглии из культур гранулярных клеток мозжечка. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейробиологии, например, какое влияние микроглия оказывает на нейроны при различных условиях и какое значение эти эффекты имеют для нашего понимания нейродегенеративных расстройств, таких как болезнь Альцгеймера и Паркинсона.

Как правило, люди, плохо знакомые с этой техникой, испытывают трудности, потому что работа с первичными культурами требует точности и скорости. Начните эту процедуру со сбора мозжечка от четырех до семи дней крысят. Поместите их сразу в чашку Петри, содержащую пять миллилитров раствора А на льду.

Затем удалите излишки раствора из мозжечка и поместите салфетку в крышку чашки Петри. Затем мелко нарежьте ткань лезвием бритвы как минимум в трех разных направлениях. Впоследствии добавьте измельченную ткань в раствор В. Поместите его на водяную баню при температуре 37 градусов Цельсия на пять минут и аккуратно встряхивайте каждые пару минут.

Затем добавьте в пробирку 20 миллилитров раствора D для нейтрализации трипсина, встряхните в центрифуге при 60 5G в течение пяти минут. Потом. Слейте S надосадочную жидкость, ресуспендированную в четырех миллилитрах раствора КТ три. Оценивайте образец по 10 раз каждой из трех пипеток из пламенного стекла уменьшающегося диаметра до тех пор, пока суспензия не станет максимально однородной.

Затем медленно и осторожно добавьте несколько капель этого гомогената поверх B-S-A-E-B-S-S, если он начинает проникать через B-S-A-E-B-S-S-T тритрат больше и добавьте немного больше раствора C. Гомогенат должен сидеть слоем поверх B-S-A-E-B-S-S. Крутите его при 100 G в течение пяти минут и не встряхивайте. Затем удалите надосадочную жидкость и снова поддержите нёбо.

В одном миллилитре среды MEM подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра и наведите на них 800 000 клеток на покрытие. После этого влейте 500 микролитров среды MEM, поместите его в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия с 6% углекислого газа. Затем делают раствор МЭМ-среды, содержащей 10 микроляров ингибитора клеточного цикла RC. Для каждого покровного стекла сохраняют 250 микролитров старой среды в свежей 24-луночной пластине, а остальное аспирируют.

Добавьте 250 микролитров обычной среды MEM для промывки клеток. Затем добавьте 250 микролитров старой среды обратно в клетки и долейте 250 микролитров среды, содержащей RSE. В этой процедуре добавьте чистую LME к пяти миллилитрам среды MEM, чтобы получить конечную концентрацию 150 миллимолярных LME.

Верните раствор к pH 7,4 с помощью раствора на кислотной основе. Затем стерильно отфильтровать его с помощью 28-миллиметрового ПЭС со шприцем фильтром 0,2 микрометра. Далее раствор LME разбавляют до концентрации 50 миллимоляров в среде MEM.

Затем поместите его на водяную баню при температуре 37 градусов Цельсия на 10 минут вместе с обычной средой MEM для контрольных культур. Через 10 минут удалите по 250 микролитров среды MEM из каждой культуры CGC. Затем удерживайте среду при температуре 37 градусов Цельсия.

Затем обрабатывайте клетки средой MEM, содержащей в два раза больше LME, или предварительно теплой средой MEM без LME Для контрольных культур инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия во влажной атмосфере с 6% углекислым газом в течение одного часа. После этого дважды промойте элементы в свежей предварительно подогретой среде MEM, чтобы удалить среду, содержащую LME. Затем замените оставленную питательную среду равным количеством свежей предварительно подогретой МЭМ-среды.

Наконец, инкубируйте культуры в 6% увлажненном углекислом газе при температуре 37 градусов Цельсия в течение 24 часов перед любой дальнейшей обработкой. На этом рисунке представлены репрезентативные изображения из экспериментов, проведенных на культурах CGC после обработки 25-75 миллимолярными LME в течение одного часа с последующим смыванием. Иммунохимия проводилась с DPI для количественной оценки общего количества клеток и клеток с апоптотической морфологией и ISO лектином B 4 для идентификации и количественной оценки микроглии. На этом графике показана количественная оценка клеток, демонстрирующих морфологию апоптоза, показанные здесь, являются репрезентативными изображениями из экспериментов, проведенных на культурах CGC после обработки 25 миллимолярными LME в течение одного часа.

Иммунохимический анализ проводили с помощью тубулина DAPI anti beta three для идентификации изменений плотности нейронов и anti GFAP для идентификации изменений плотности и морфологии астроцитов. Отрицательные контрольные изображения представляют культуры CGC, в которых первичные антитела были опущены после освоения. Эту технику можно выполнить примерно за два часа, если она выполнена правильно.