Ловушка-RC, переводя рибосом Affinity Очистка от редких клеточных популяций Drosophila Эмбрионы

Общая цель этой процедуры заключается в выделении участвующей в трансляции РНК специфическим типом клеток у эмбрионов дрозофилы. Это достигается путем предварительного сбора эмбрионов из трансгенной линии мухи, что позволяет обеспечить специфическую экспрессию меченной A GFP рибосомной субъединицы в целевом типе клеток, в данном случае в мышечных клетках. Вторым этапом является получение лизата для получения полисомного препарата, содержащего смесь меченых и немеченых рибосом.

Затем оценивают концентрацию белка в лизате и проводят аффинную очистку с помощью гранул, соединенных с антителами GFP, для захвата комплексов рибосомной РНК из интересующего типа клеток. Заключительный этап посвящен триолу, РНК, экстракции и очистке. В конечном счете, оценка качества и специфичности выполняется с помощью биоанализатора и R-T-Q-P-C-R соответственно.

Затем РНК может быть использована для глобального количественного анализа с помощью секвенирования РНК или микрочипов. Основным преимуществом данной методики нашего существующего метода, как и VX сортировки, является то, что она не требует лабо-стадии диссоциации клеток. Его можно выполнять на стенде.

Это быстро и позволяет напрямую идентифицировать транслируемую РНК в очень небольшой популяции клеток, что является значительным преимуществом для понимания приобретения клеточных свойств. Даже если этот метод может дать представление о миогенезе у эмбриона Жозефины, он также может быть применен к другим тканям или современным организмам, таким как растение, зебра, рыба или мышь, а также может помочь в последующем влиянии лечения на синтез белка в случае патологии. Демонстрируя процедуру Бенджамин Берта, аспирант из моей лаборатории После проектирования, обе трансгенные линии в соответствии с инструкциями в письменной части протокола и скрещивание для создания ловушки двойного креста трансгенной линии, амплифицируют линию, сначала подготавливая восемь больших цилиндрических клеток для популяции, содержащих около 40 граммов молодых мух в каждой клетке. что соответствует примерно 180 000 мух на клетку.

Приготовьте чашки Петри диаметром 11 сантиметров, содержащие смесь застывшего агара и виноградного сока, с одной третью поверхности, покрытой свежеприготовленной дрожжевой пастой, и дайте мухам отложить яйца на эти тарелки в течение часа. Повторите этот процесс еще на двух наборах тарелок со свежим виноградным соком, чтобы позволить мухам полностью опорожнить свои члены. Желаемые двойные трансгенные эмбрионы от скрещивания будут заложены на четвертую пластину.

Извлеките из клеток пластины, содержащие желаемые эмбрионы, и дайте им инкубироваться до желаемой стадии развития при комнатной температуре. Здесь используется 13-часовая инкубация. Затем повторно суспендируйте содержимое пластины примерно 50 миллилитрами воды с помощью щетки.

Отделяют зародыши от мертвых мух, пропуская жидкость через три сита диаметром 700, 355 и 112 мкм. Собранные зародыши промойте в сите наименьшего диаметра с ионизированной водой. Покройте эмбрионы в 4,5% отбеливателе в ионизированной воде в течение двух минут, а затем тщательно промойте ионизированной водой в течение 30-60 секунд.

Инкубируйте эмбрионы в PBS 0,01%T в диапазоне от 20 до 100 микрограммов на миллилитр. Цикло хайде от пяти до 10 минут при комнатной температуре с перемешиванием. После сушки эмбрионов на целлюлозных абсорбирующих листах перенесите их в микроцентрифужные пробирки, затем взвесьте пробирки и прошите, заморозьте эмбрионы путем погружения в жидкий азот.

На этом этапе высушенные эмбрионы могут храниться в течение нескольких месяцев при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Trend переносят 1,5 грамма высушенных эмбрионов в предварительно охлажденные 15-миллилитровые пробирки, содержащие четыре миллилитра экстракции полисом, буферные и гомогенизированные. С помощью стерильной серологической пипетки объемом 10 миллилитров.

Затем распределите гомогенизированные эмбрионы в две пробирки для предварительного охлаждения по два миллилитра и измельчите эмбрионы в многонаправленной скоростной измельчителе бисера. Настроен на двойной запуск в течение 10 секунд при 5 000 об/мин с 15-секундной паузой между каждым циклом. После 10 минут центрифугирования при 2000 G переложите лизат в свежую предварительно охлажденную микроцентрифужную пробирку на льду.

Добавьте 10%non P 40 в надосадочную жидкость S до конечной концентрации 0,1% и аккуратно перемешайте, перевернув пробирку. Добавьте 300 микромолей DHPC до конечной концентрации 30 миллимоляров и аккуратно перемешайте, перевернув пробирку. Инкубируйте смесь на льду в течение пяти минут, перемешивая путем инверсии несколько раз за время инкубации.

После инкубации во льду. Приготовьте постмитохондриальный супинат центрифугированием при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут при 20 000 G. После измерения концентрации белка по методу Брэдфорда и получения концентрации белка от 60 до 80 мг на миллилитр перенесите SNAT в свежую предварительно охлажденную микроцентрифужную пробирку и немедленно приступайте к этапу предварительной абсорбции. Восстановите магнитные шарики с помощью осторожного перемешивания, а затем переложите 30 микролитров шариков на каждый миллилитр лизата в микроцентрифужную пробирку.

Соберите шарики на магните, отсоедините пипеткой и ресуспендируйте шарики и 500 микролитров буфера для экстракции полисом. Далее соберите бусины на магнит. Снова добавьте эмбриональный, лизат и инкубируйте в течение одного часа при четырех градусах Цельсия на ротаторе.

Удалите шарики и положите лежачее средство на лед до этапа иммуноочищения. Зарезервировав 100 микролитров супината в качестве образца глобальной РНК для сравнения с образцом, собранным после иммуноочистки, для иммуноочистки образца добавьте один миллилитр предварительно абсорбированного лизата в свободную РНК-пробирку, содержащую 90 микролитров заблокированных шариков, связанных с антителами GFP. После инкубации образец инкубируется при температуре четыре градуса Цельсия в течение двух часов или в течение ночи с аккуратным перемешиванием из конца в конец в ротаторе пробирки.

Промойте бусины, сначала открутив оставшиеся бусины в мини-центрифуге. Затем соберите на магните ресуспендию в 500 микролитрах промойте, буферизуйте и инкубируйте по мере необходимости. Закончите перемешивание на 10 минут в холодном помещении и снова соберите бусины на магните.

Переложите бусины в свежую пробирку без защитных R РНК и промойте еще дважды. Наконец, собрав бусины на магните, приступайте к экстракции РНК, добавив в бусины один миллилитр ТРИОЛА и выполнив экстракцию в соответствии с инструкциями производителя. После этого выполните очистку РНК с помощью микронабора RNEZ в соответствии с инструкциями производителя.

Чтобы проверить специфичность захваченной РНК, проводят обратную транскрипцию трех нанограммов иммуноочищенной и входной РНК в соответствии со стандартными процедурами. Затем используют полученную для КПКР КДНК с ген-специфичными наборами праймеров. На этом конфокальном изображении эмбриона 16-й стадии показана экспрессия RPL 10 A-E-G-F-P, в частности, в шести сутулых мышечных клетках в каждом сегменте HEMI, наблюдается колокализация RPL 10 A-E-G-F-P с общим мышечным маркером бета-3 тубулином.

Захваченную РНК прогоняли на биоанализаторе с целью контроля качества. Обратите внимание на идеальную целостность одной восьмилучевой и двух восьмивосьмилучевой рибосомных РНК. На этом рисунке представлены результаты анализа RT QPCR на трех биологических репликах эмбрионов 16 стадии и демонстрируется высокая специфичность мРНК, изолированной от ловушек.

Изменение FO было рассчитано по сравнению с входом и нормализовано по отношению к метамфетамину гена RPL 32. Два транскрипта, присутствующие во всех мышечных линиях, обогащены в 2,3 раза по сравнению с входом, в то время как более ограниченные сутулые транскрипты обогащены в 5,6 раза нервными клетками, экспрессирующими просперо и носки, и гены истощены в 2,2 и 5,5 раза соответственно после его развития. Этот метод проложил путь для исследователей, особенно в области биологии развития, к изучению приверженности самопомощи и приобретению клеточных свойств во время дифференцировки эмбрионов doof.