Ловушка-RC, переводя рибосом Affinity Очистка от редких клеточных популяций

Общая цель данной процедуры заключается в изоляции РНК, участвующей в трансляции, специфично для определенного типа клеток в эмбрионах Drosophila. Это достигается путем предварительного сбора эмбрионов трансгенной линии мух, обеспечивающей специфическую экспрессию рибосомальной субъединицы с GFP-меткой в целевом типе клеток, в данном случае — в клетках мышц slouch. На втором этапе создается лизат для получения препарата полисом, содержащего смесь меченых и немеченых рибосом.

Затем определяют концентрацию белка в лизате и проводят аффинную очистку с помощью сорбентов, конъюгированных с антителами к GFP, для выделения рибосомальных РНК-комплексов из интересующего типа клеток. Заключительный этап посвящен экстракции и очистке тотальной РНК. В конечном итоге с помощью биоанализатора и ОТ-КПЦР проводят оценку качества и специфичности соответственно.

Затем РНК может быть использована для глобального количественного анализа с помощью секвенирования РНК или микрочипов. Главным преимуществом данной методики по сравнению с нашим существующим методом, таким как сортировка VX, является то, что она не требует трудоемкого этапа диссоциации клеток. Эту процедуру можно проводить непосредственно на лабораторном столе.

Этот метод характеризуется высокой скоростью и позволяет напрямую идентифицировать транслируемую РНК в очень малых популяциях клеток, что дает значительное преимущество для понимания процессов приобретения клетками определенных свойств. Хотя данный метод позволяет изучить миогенез в эмбрионе Josephine, он также может быть применен к другим тканям или модельным организмам, таким как растения, данио-рерио или мыши, а также может помочь в отслеживании влияния терапии на синтез белка при патологиях. Процедуру продемонстрирует Бенджамин Берта, аспирант моей лаборатории. После создания обеих трансгенных линий в соответствии с инструкциями в текстовой части протокола и их скрещивания для получения двойной трансгенной линии-ловушки, увеличьте популяцию линии, предварительно подготовив восемь больших цилиндрических клеток, содержащих примерно 40 г молодых мух в каждой, что соответствует примерно 180 000 мух на клетку.

Подготовьте чашки Петри диаметром 11 сантиметров, содержащие смесь застывшего агара и виноградного сока, при этом одна треть поверхности должна быть покрыта свежеприготовленной дрожжевой пастой; оставьте мух откладывать яйца на эти чашки в течение одного часа. Повторите эту процедуру еще с двумя наборами свежих чашек с виноградным соком, чтобы мухи могли полностью опорожнить свои протоки. Желаемые двойные трансгенные эмбрионы, полученные в результате скрещивания, будут отложены на четвертую чашку.

Извлеките чашки с нужными эмбрионами из клеток и оставьте их инкубироваться при комнатной температуре до достижения желаемой стадии развития. В данной методике используется 13-часовая инкубация. Затем, используя кисть, ресуспендируйте содержимое чашки примерно в 50 миллилитрах воды.

Отделите эмбрионы от погибших мух, пропустив жидкость через три сита с диаметрами ячеек 700, 355 и 112 микрон. Промойте собранные эмбрионы в сите с наименьшим диаметром ионизированной водой. Обработайте эмбрионы 4,5% раствором отбеливателя в ионизированной воде в течение двух минут, а затем тщательно промойте ионизированной водой в течение 30–60 секунд.

Инкубируйте эмбрионы в PBS 0.01%T с концентрацией циклогексида от 20 до 100 micrograms per milliliter в течение 5–10 минут при комнатной температуре с перемешиванием. После просушивания эмбрионов на целлюлозных абсорбирующих листах перенесите их в микроцентрифужные пробирки, затем взвесьте пробирки и подвергните эмбрионы мгновенному замораживанию путем погружения в жидкий азот.

На этом этапе высушенные эмбрионы можно хранить в течение нескольких месяцев при температуре -80 °C. Перенесите 1,5 г высушенных эмбрионов в предварительно охлажденные пробирки объемом 15 мл, содержащие 4 мл буфера для экстракции полисом, и гомогенизируйте смесь с помощью стерильной серологической пипетки объемом 10 мл.

Затем распределите гомогенизированные эмбрионы по двум предварительно охлажденным пробиркам объемом 2 мл и измельчите их в многонаправленном высокоскоростном бисерном гомогенизаторе. Установите два цикла по 10 секунд при 5 000 RPM с паузой 15 секунд между циклами. После центрифугирования в течение 10 минут при 2000 G перенесите лизат в новую предварительно охлажденную микроцентрифужную пробирку на льду.

Добавьте 10% NP-40 в супернатант S до конечной концентрации 0.1% и осторожно перемешайте, переворачивая пробирку. Добавьте 300 мкМ DHPC до конечной концентрации 30 мМ и осторожно перемешайте, переворачивая пробирку. Инкубируйте смесь на льду в течение пяти минут, несколько раз перемешивая путем переворачивания пробирки во время инкубации.

После инкубации на льду подготовьте постмитохондриальный супернатант путем центрифугирования при 4 °C в течение 10 минут при 20 000 G. После измерения концентрации белка методом Брэдфорда и достижения концентрации белка от 60 до 80 mg/mL перенесите супернатант в новую предварительно охлажденную микроцентрифужную пробирку и немедленно перейдите к этапу предварительной абсорбции. Ресуспендируйте магнитные бусины при осторожном перемешивании, затем перенесите 30 µL бусин на каждый миллилитр лизата в микроцентрифужную пробирку.

Соберите гранулы с помощью магнита, удалите супернатант пипеткой и ресуспендируйте гранулы в 500 microliters буфера для экстракции полисом. Затем снова соберите гранулы на магните. Добавьте эмбриональный лизат и инкубируйте в течение одного часа при температуре four degrees Celsius на ротаторе.

Удалите гранулы и поместите супернатант на лед до этапа иммуноочистки. Отберите 100 µL супернатанта в качестве общего образца РНК для сравнения с образцом, полученным после иммуноочистки. Для проведения иммуноочистки добавьте 1 мл предварительно абсорбированного лизата в свободную от РНК пробирку, содержащую 90 µL блокированных гранул, конъюгированных с антителами к GFP. Инкубируйте образец при температуре 4 °C в течение двух часов или в течение ночи, обеспечивая осторожное перемешивание в ротаторе для пробирок методом полного переворота.

Промойте гранулы, предварительно осадив оставшиеся гранулы в миницентрифуге. Затем соберите их с помощью магнита, ресуспендируйте в 500 microliters промывочного буфера и инкубируйте. После перемешивания выдержите 10 minutes в холодильной комнате и снова соберите гранулы с помощью магнита.

Перенесите гранулы в новую пробирку, предварительно обработанную средством для удаления РНК, и промойте еще дважды. В завершение, собрав гранулы с помощью магнита, приступайте к экстракции РНК, добавив к гранулам 1 mL TRIOL и выполнив экстракцию в соответствии с инструкциями производителя. Затем проведите очистку РНК с использованием набора RNEZ micro согласно инструкциям производителя.

Для проверки специфичности захваченной РНК проведите обратную транскрипцию 3 нг иммуноочищенной и исходной РНК в соответствии со стандартными процедурами. Затем используйте полученную кДНК для количественной ПЦР с использованием ген-специфических наборов праймеров. На данном конфокальном изображении эмбриона на стадии 16 видна экспрессия RPL 10 A-E-G-F-P, конкретно в шести клетках мышц slouch в каждом сегменте HEMI; наблюдается колокализация RPL 10 A-E-G-F-P с общим маркером мышц бета-3-тубулином.

Выделенная с помощью метода TRAP РНК была проанализирована на биоанализаторе для контроля качества. Обратите внимание на идеальную целостность 18S и 28S рибосомных РНК. На данном рисунке представлены результаты анализа RT-qPCR трех биологических повторов эмбрионов на 16-й стадии, которые демонстрируют высокую специфичность мРНК, выделенной методом TRAP.

Изменение FO рассчитывали по сравнению с исходным материалом и нормировали относительно метилирования гена RPL 32. Два транскрипта, присутствующих во всех мышечных линиях, обогащены в 2,3 раза по сравнению с исходным материалом, тогда как более ограниченные транскрипты slouch обогащены в 5,6 раза; в нервных клетках, экспрессирующих prospero и socks, гены истощены в 2,2 раза и 5,5 раза соответственно после их развития. Этот метод открыл исследователям, особенно в области биологии развития, путь к изучению детерминации клеточных линий и приобретения свойств клеток в процессе дифференцировки эмбрионов doof.