Наблюдение за Мерцательная Движения сосудистое сплетение эпителиальных клеток Экс Vivo

Общей целью данного эксперимента является анализ движения эпителиальной клетки сосудистого сплетения, Celia ex vivo. Это достигается путем предварительного вырезания мозга из эмбриона или щенка мыши для выделения ткани сосудистого сплетения. Движение ресничек визуализируется с помощью дифференциального интерференционного контраста, или DIC-микроскопии, а затем создается цифровой фильм кончиков ресничек для ручного отслеживания положения кончиков ресничек.

В конечном счете, восстановленные движения кончиков Celia классифицируются и количественно оцениваются на основе моделей их движений. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы клеточной биологии, такие как как контроль смертности целии во время развития и как модель мобильности меняется с течением времени? Следствием применения этих методов был физиологический анализ пути и диагностика.

Болезни, связанные с Сирией, поскольку наше фундаментальное понимание кинетической Сирии все еще подстегивают. Начните с того, что поместите неонатальную мышь, промытую на 70% этанолом, голову в ледяной Libovitz L 15, среднюю в стерильную 10-сантиметровую посуду сразу после обезглавливания. Затем с помощью щипцов часовщика снимите скальп с черепа.

Затем разрезают череп по срединному сечению вдоль продольного шва, чтобы обнажить мозг, с последующим разрезанием черепных нервов, чтобы извлечь весь орган. Перенесите изолированный мозг в новую чашку, наполненную свежим льдом, холодной средой, тыльной стороной вверх и поместите чашку под стереомикроскоп. Затем сориентируйте ткань так, чтобы обонятельные луковицы располагались в положении «три часа», и осторожно обхватите мозг часовыми щипцами.

Другой рукой используйте тонкие щипцы для рассечения мозговых пунцов, соединяющих полушария мозга с мозговым стволом. Отжмите головной мозг Диона, чтобы еще больше отделить полушария и поместить поверхность разреза вверх, с последующим оттягиванием пластинки афии, чтобы удалить латеральное желудочковое сосудистое сплетение, прикрепленное к латеральной стороне гиппокампа. После того, как сосудистое сплетение будет изолировано, перенесите ткань в стеклянную чашку со стеклянным дном диаметром 35 мм, содержащую свежую среду, и поместите груз на ткань, чтобы аккуратно удерживать ее на месте в течение 25-60 минут после эвтаназии, начните визуализацию эпителиальной клетки сосудистого сплетения Целиии в реальном времени, регулируя фокус линзы объектива на глаз.

Отрегулируйте конденсор так, чтобы центр и фокус соответствовали освещению Кула. Затем вставьте соответствующие оптические элементы в световой тракт в соответствии с оптикой DIC. Переместите призму DIC, чтобы отрегулировать контрастность изображений в положение, при котором структура поверхности ткани будет четко различима.

Затем переключите световой путь на видеокамеру и увеличьте мощность света. Сняв фильтры нейтральной плотности, отрегулируйте поле наблюдения и фокусировки, установив временное разрешение видеокамеры на 200 герц и время экспозиции на 0,1 миллисекунды для желаемого периода изображения. Затем получите изображения после того, как стек изображений будет получен, каждый отдельный кадр будет отображать четкое изображение Селии, чтобы вручную отслеживать паттерны биения каждой реснички.

С помощью указателя мыши отметьте положение кончиков ресничек в каждом кадре. Затем с помощью соответствующего программного обеспечения проанализируйте данные траектории и классифицируйте траектории на один из двух режимов движения вперед и назад или вращательный на глаз. Используя формулу, рассчитайте частоту биения ресничек для нескольких циклов биения ресничек.

Как и другие целии на одной и той же клетке могут мешать движению каждой реснички. Далее необходимо проанализировать угловую равномерность биения ресничных осей в пределах одной ячейки. Для траекторий вперед и назад подгоняйте положения кончиков Целии к прямой линии, определяя тету как угол, который линия образует с осью X.

Для траекторий вращения подгоните положения к эллипсу, определяющему тету как угол, который большая ось эллипса образует с осью x. Наконец, для количественного описания каждой траектории поверните траектории с помощью тета, определив их отношения сторон как отношения между ширинами их распределения по оси x и y. В этом первом клипе показан вид сверху эпителиальных клеток сосудистого сплетения с Celia от щенка мыши второго дня после рождения, полученный с помощью высокоскоростной видеомикроскопии, неровная поверхность ткани сосудистого сплетения делает ее видимой как в фокусной, так и в расфокусированной плоскостях.

Во втором клипе показано увеличенное изображение квадратной области из предыдущего фильма, что позволяет более внимательно наблюдать за вращательными движениями и движениями вперед и назад, демонстрируемыми отдельными ресничками. Здесь представлены траектории репрезентативных движений ресничных кончиков, восстановленные по кинозаписям в течение нескольких циклов, с временными ходами координат x и y положений кончиков, нанесенных на графики. Чтобы продемонстрировать фазовый сдвиг между двумя координатами на этих графиках, координаты x и Y были нормализованы и наложены.

В то время как подвижные CLIA легко распознаются с помощью визуализации в реальном времени, идентифицировать неподвижные CLIA с помощью этого метода непросто. Чтобы преодолеть эту трудность, сканирующая электронная микроскопия может быть незаменимой для получения целых изображений клиумов независимо от их подвижности. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о том, что вскрытие должно выполняться достаточно быстро, чтобы сохранить свежесть образца и сохранить подвижность Сирии.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как готовить образцы тканей с вирусными злаками, а также как контролировать и количественно оценивать смертность CX vivo.