Грызунов Мозг Микроинъекция по изучению молекулярных субстратов мотивированное поведение

Общая цель данной процедуры заключается в точном изготовлении канюли и микроинъекторов, а также в правильном выполнении микроинъекций. Это достигается путем предварительного изготовления канюли соответствующей длины. Вторым этапом является резка и сборка микроинжекторов.

Далее подготовьте микроинжекторы, трубки и насос для микровпрыска. Заключительным этапом является завершение микроинъекции и прохождение периода диффузии. В конечном счете, микроинъекция используется для точного введения реагентов в нужную область мозга, демонстрируя правильное обращение.

Во время микроинъекции будет Райан Поланд, студент в моей лаборатории. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности, потому что необходимо проявлять особую осторожность, и все шаги требуют большого внимания, чтобы обеспечить правильное размещение канюли и место микроинъекции. Чтобы подготовить канюлю, сначала нарисуйте на ленте 15-миллиметровую опорную линию с помощью ручки с тонким наконечником.

Затем используйте его в качестве ориентира для разметки 15-миллиметровых участков последовательно на трубке острым перманентным маркером. Затем сделайте надрез на трубке канюли, прикоснувшись ею к медленно вращающемуся отрезному диску вращающегося инструмента. В отмеченных точках поверните канюлю на 180 градусов и сделайте надрез на противоположной стороне трубки.

Не разрезайте трубку полностью, так как это может привести к окклюзии. После этого резко согните трубку, чтобы разбить ее на 15-миллиметровые участки. Затем держите каждый конец канюли перпендикулярно отрезному диску между большим и указательным пальцами.

Вращайте трубку канюли, касаясь ее кончика к поверхности отрезного диска, чтобы получился тупой наконечник. Затем разверните оба конца канюли иглой со скошенной углом 26 калибра, чтобы убедиться, что все заусенцы были удалены и что канюля не заблокирована. Для приготовления обтуратора зажима одной канюли примерно половинной длины с помощью прямых гемостатиков среднего веса, уложите заблокированный гемостат на скамью так, чтобы канюля была перпендикулярна скамье.

Затем введите один конец провода атора в канюлю до тех пор, пока он не достигнет скамьи. Согните проволоку, защипывая пальцами до достижения угла в 30 градусов, сохраняя при этом контакт между обтюратором и скамейкой. После этого извлеките проволоку из канюли и отрежьте лишнюю часть на 2,5 миллиметрах от изгиба небольшими диагональными резаками.

При этой процедуре держите один конец трубки микроинжектора перпендикулярно заблокированному прямому гемостату. Скрутите гемостат, сохраняя натяжение на трубке, и плотно обмотайте его вокруг гемостата хотя бы один раз. Затем измерьте расстояние 32 миллиметра от противоположного свободного конца трубки микроинжектора и захватите эту точку перпендикулярно вторым гемостатом.

Сгибайте трубку вперед и назад, сохраняя натяжение до тех пор, пока она не разорвется. Затем осмотрите трубку микроинжектора, чтобы убедиться, что оба конца прямые, а внутренний диаметр не имеет препятствий. Нарисуйте на рулетке пятимиллиметровую контрольную линию и последовательно отметьте пять миллиметровых участков трубки канюли с помощью перманентного маркера.

Затем прикоснитесь трубкой канюли к медленно вращающемуся отрезному диску в отмеченных точках, чтобы сделать надрез на трубке. Затем резко согните трубку с кольцом микроинжектора для того, чтобы разломать ее на пятимиллиметровые участки. Наденьте по одному хомуту на каждую трубку микроинжектора примерно в двух сантиметрах от конца.

Нанесите небольшое количество суперклея на микроинжекторную трубку на расстоянии пяти миллиметров от одного конца. Затем наденьте воротник на суперклеевой шарик так, чтобы он находился в одном миллиметре от конца трубки для микроинъекций. После этого обмажьте оба конца воротника клеем.

Затем приложите иглу 26 калибра к одномиллилитровому шприцу, наполненному стерильной водой. И наденьте восьмисантиметровый кусок пластиковой трубки микроинъектора на иглу, следя за тем, чтобы не проколоть трубку, после чего наденьте другой конец пластиковой трубки на конец воротника высушенного микроинъектора. Нажмите на наполненный водой поршень шприца для проверки на патент C.In этом шаге, согните готовый микроинъектор на 15 миллиметров от конца, противоположного воротнику, на 95 градусов.

Далее разрежьте пластиковую трубку на 70 сантиметров и наденьте ее на кольцо микроинжектора. Чтобы подготовить насос к микроинъекции, установите диаметр иглы для микроинъекций, желаемую скорость инфузии и целевой объем инъекции на трубке. Затем установите режим помпы на громкость, чтобы точный объем подавался автоматически.

Затем отрегулируйте обратный упор насоса, чтобы шприц мог быть заполнен до объема инъекции плюс дополнительные 0,2 микролитра. Теперь поместите кончик герметичного шприца в стерильную воду, содержащуюся в небольшой сывороточной лодочке, и осторожно взмахните поршнем, чтобы равномерно смазать внутреннюю проволоку. Потяните поршень до упора на насосе, чтобы заполнить иглу микровпрыска водой.

Следующий слайд. Трубка из полиэтилена 20, которая подключена к микроинжектору на игле 26 калибра, прикрепленной к шприцу, наполненному стерильной водой объемом один миллилитр. Распылите стерильную воду через микроинжектор и проверьте форму и расстояние распыления.

Затем поместите стерилизованный микроинъектор на стерильное поле. Сдвиньте трубку с иглы, разрежьте трубку ниже участка, поврежденного иглой, сохраняя ее в вертикальном положении, чтобы вода не вытекла. Затем слегка сдвиньте поршень шприца микроинъектора вперед, чтобы на конце иглы образовалась капля, и наденьте заполненную водой трубку PE 20 на иглу.

После этого полностью выдвиньте поршень вперед, чтобы подготовиться к загрузке образца и убедиться, что в микроинжекторе не осталось следов этанола. Проверьте настройку на наличие утечек, несколько раз коснувшись капли воды, образовавшейся на кончике микроинжектора, чистой лабораторной салфеткой. Затем оттяните поршень шприца назад на 0,2 микролитра, чтобы создать пузырь между стерильной водой и трубкой PE 20 и раствором, который будет вводиться.

После этого поместите микроинжектор в реагент, который нужно впрыснуть, и медленно потяните поршень шприца к упору. Чтобы подготовить животное к инъекции, прижмите грудь крысы к груди экспериментатора. Очистите область вокруг канюли с помощью ватного аппликатора, смоченного в бетадине.

Промокните головную уборку три раза бетадином, а затем два раза проведите тампон с этанолом. Затем поместите заполненный микроинъектор в канюлю. Нажмите «Пуск» на микронасосе впрыска и следите за движением пузырьков.

Когда инъекция будет завершена, извлеките микроинъектор из канюли и замените его обтуратором. На этом рисунке показана трансфекция области астроцитов прилежащего ядра микроинъекцией вируса, а на этом рисунке показано снижение мотивации крыс к самостоятельному введению этанола путем активации трансгена, который был чрезмерно экспрессирован в прилежащем ядре. Активация страха центрами ядра астроцитов при системном введении ХНО значительно снижала мотивацию крыс к самостоятельному введению этанола после воздержания по сравнению с носительными ЧНО, что не имело никакого эффекта в одинаково обученной когорте, которая экспрессировала ГФП вместо того боя, который он когда-то освоил.

Этот метод может обеспечить индивидуальные инструменты для микроинъекций в мозг и еще большую гибкость экспериментальных процедур. Пробуя эту процедуру, важно помнить, что точное место микроинъекции является обязательным условием для достижения желаемого эффекта.