Справочное Отвар микроразведения Метод Dalbavancin In Vitro Восприимчивость Тестирование бактерий, которые растут аэробной

Общей целью данной процедуры является определение минимальной ингибирующей концентрации далбаванцина. Для этого используется метод микроразведения бульона с акцентом на ключевые этапы, которые являются уникальными для Dalbavancin. Исходное и промежуточное разведение далбаванцина производят в ДМСО, а окончательное разведение – в катионах на отрегулированном бульоне Мюллера-Хинтона с добавлением полисорбата.

Разведения дозируют в 96-луночный планшет и инокулируют стандартизированной суспензией бактерий. Затем планшет инкубируют в течение 16-24 часов и исследуют, чтобы определить минимальное количество дальбаванцина, необходимое для подавления роста бактерий. Следование этому стандартизированному методу обеспечит стабильные результаты с обоими клиническими изолятами, и, как показано здесь, изоляты контроля качества Дальбаванцин является полусинтетическим антимикробным средством на основе липоглипептида, которое было одобрено в мае 2014 года FDA для лечения острых бактериальных инфекций кожи и структуры кожи, вызванных грамположительными микроорганизмами.

Данный способ описывает стандартизированный бульон, микроразведение чувствительности к дассину, который включает использование ДМСО для приготовления исходных растворов в полисорбате 80 для облегчения адгезии агента к пластику. Поскольку исходное сырье и планшет MIC стадии приготовления раствора не являются типичными по сравнению с большинством антимикробных средств. Эти шаги уникальны для липогликопептидных агентов и важны для достижения воспроизводимых и точных результатов MIC.

Демонстрировать процедуру будет Джина Фишер, научный сотрудник моей лаборатории. Обратите внимание, что при выполнении следующей процедуры следует применять соответствующие меры предосторожности, соответствующие второму уровню биобезопасности. Начните с взвешивания соответствующего количества далбаванцина, чтобы приготовить стоковый раствор 800 микрограмм на миллилитр.

Добавьте соответствующее количество NEAT DMSO в стерильный стеклянный или пластиковый тюбик, затем перенесите порошок в пробирку и закрутите его. Следующий. Используя стоковый раствор DALBAVANCIN в концентрации 800 мкг на миллилитр, приготовьте 100 окончательных концентраций в планшетах MIC, как показано в столбцах с первого по четвертый. Они называются промежуточными концентрациями.

Общий подготовленный объем будет зависеть от количества панелей MIC. Наконец, разбавляют промежуточные концентрации от одного до 100 в нерегулируемом катионном бульоне Мюллера-Хинтена, также известном как C-A-M-H-B, с добавлением 0,004%P 80. Результирующая рабочая концентрация DALBAVANCIN и P 80 в два раза превышает конечную концентрацию.

Поскольку добавление инокулюма приведет к одному-двукратному разведению с помощью многоканальной пипетки со стерильными наконечниками, диспенсируйте по 50 микролитров каждого разведения дальбаванцина в соответствующие лунки 96-луночной стерильной микроразбавляющей панели. Формат пластины MIC позволяет тестировать восемь иноклей на одну пластину. Если панели не будут использоваться сразу, нанесите полиэтиленовую пленку для их герметизации, затем поместите их в полиэтиленовые пакеты и храните в морозильной камере без размораживания при температуре не менее минус 60 градусов Цельсия до тех пор, пока они не понадобятся.

В этой демонстрации будет сделана прививка одной свежеприготовленной тарелки. Чтобы приготовить инокулюм, выберите несколько хорошо изолированных колоний с помощью 18-24-часового шнека для крови или другой неселективной шнековой пластины. Здесь используются арии контроля качества и мозолистые деформации EPHI.

Прикоснитесь к верхней части каждой колонии стерильным тампоном и перенесите часть его в пробирку, содержащую от одного до пяти миллилитров C-A-M-H-B или физиологического раствора. Продолжайте перекладывать до тех пор, пока мутность не достигнет стандарта 0,5 по Макфарланду в течение 15-30 минут после приготовления, разбавьте инокуляцию от одного до 100 в C-A-M-H-B, чтобы получить концентрацию от пяти до 10 до пятого КОЕ на миллилитр. Допустимый диапазон составляет от двух до восьми умножить на 10 до пятой КОЕ на миллилитр.

Немедленно с помощью многоканальной пипетки со стерильными наконечниками переведите 50 микролитров конечного инокулята в каждую соответствующую лунку пластины панели MIC здесь. Каждый из двух изолятов инокулируется в четыре ряда, всего четыре репликации на изолят. Затем, чтобы выполнить проверку чистоты, с помощью пипетки переведите от одного до 10 микролитров раствора с положительным контролем роста в неселективный агар, например, соевый агар Decay с 5% овечьей крови.

Используйте стерильную петлю для распределения раствора по поверхности пластины. Поверните пластину на 90 градусов и снова протрите, чтобы убедиться, что инокулюм равномерно распределен. Накройте тарелку крышкой и отставьте ее в сторону.

При подготовке к подсчету колонии используйте одноканальную пипетку, чтобы перевести 10 микролитров раствора из лунки для контроля роста на 10 миллилитров солевой смеси, а затем переведите 100 микролитров в подходящую неселективную сельскохозяйственную среду, например, попробуйте соевый агар с 5% овечьей крови с использованием стерильной петли, распределите раствор по всей поверхности сельского хозяйства. Повторите этот процесс два раза в разных направлениях, чтобы обеспечить равномерное распределение инокулята. Затем сложите до четырех панелей MIC в пластиковый контейнер, убедившись, что верхняя панель плотно закрыта крышкой.

Затем поместите влажное бумажное полотенце внутрь пластикового контейнера и надежно закройте его крышкой в течение 30 минут после прививки. Инкубируйте панели MIC, планшет для подсчета колоний и планшет для проверки чистоты в инкубаторе окружающего воздуха при температуре 35 плюс-минус два градуса Цельсия в течение 16–20 часов. На следующий день прочитайте минимальную ингибиторную концентрацию как самую низкую концентрацию, которая полностью подавляет рост бактерий в лунках, обнаруженных невооруженным глазом.

Определите количество колоний на табличке для подсчета колоний. Умножьте подсчитанное число на коэффициент разбавления. Например, 50 колоний умножить на коэффициент разбавления 10 000 равно пяти умножить на 10 к пятому КОЕ на миллилитр.

Приемлемый диапазон составляет от 20 до 80 колоний, что соответствует двум-восьми умножить на 10 пятых колонийобразующих единиц на мл. Концентрация инокулюма является важной переменной для контроля тестирования на чувствительность с целью получения точных результатов. Наконец, проверьте табличку чистоты.

Если все колонии схожи с колониями, используемыми в качестве инокулята, то его можно считать чистым. Если присутствуют какие-либо другие колонии, то существует вероятность присутствия загрязняющего вещества в панели MIC, и тест следует повторить. DAL bevans, результаты MIC сравнивали с результатами, полученными с использованием метода агроразбавления, как показано здесь.

Результаты Agri MIC для Dal bevans обычно в два-восемь раз выше, чем для бульона. Микроразведение, результаты MIC. Это контраст получается ванкомицином, который бывает бульонным и сельскохозяйственным методами.

Поэтому для тестирования отвара далбаванцина не рекомендуется разбавлять агри. Микроразбавление MIC, результаты контроля качества должны находиться в пределах ожидаемых пределов, как показано здесь. Организм контроля качества СС, ТСС 2 9 2 1 3 с очень четким модальным МПК 0,06 мкг на миллилитр, является хорошим индикатором вариативности метода.

Если полученные результаты выходят за пределы ожидаемых диапазонов для организмов, контролирующих качество, или имеют тенденцию к нижней или верхней границе диапазона, то требуется дальнейшая валидация метода. В дополнение к валидации метода с использованием организмов контроля качества, далбаванцина, данные MIC из региональных программ эпиднадзора за противомикробными препаратами могут послужить основой для результатов MIC, которые можно ожидать в клинических лабораторных условиях, как показано здесь, Dal b Anson MIC, результаты для изолятов, собранных в Европе и США в 2011-2013 годах, составили менее 0,25 мкг на миллилитр для 99,9% SIU и 100% стрептококков. На основании этих данных эпиднадзора очевидно, что результаты МПК далбаванцина для стафилококков и стрептококков более 0,12 мкг на миллилитр встречаются редко.

Если наблюдаются более высокие цифры, тест следует повторить или отправить в референс-лабораторию для валидации. Приготовление разведения запаса в ДМСО и добавление P 80 к разведению бульона в концентрации 0,002% в конечной лунке МПК являются важнейшими этапами для получения точных и воспроизводимых результатов МПК далбаванцина. Как всегда, но особенно в этой области развития бактериальной резистентности, точные результаты чувствительности к противомикробным препаратам имеют решающее значение для выбора клиницистом подходящей терапии.