Молекулярная зонд Оптимизация для определения клеток смертности в фотосинтезирующих организмов ( Microcystis палочки), Используя проточной цитометрии
29 января 2016 г.
Микробные популяции содержат значительное гетерогенность клеток, которые могут диктовать общее поведение. Анализ молекулярной зонд через проточной цитометрии можно определить физиологические состояния клеток, однако его применение зависит от вида. Это исследование обеспечивает протокол точно определить сотовый смертности в популяции цианобактерии, не преуменьшая или записи ложные положительные результаты.
Общая цель этой процедуры — продемонстрировать, как создать протокол, который может эффективно анализировать физиологическое состояние цианобактерий с помощью проточной цитометрии и молекулярных зондов. Этот протокол может помочь ответить на ключевые вопросы о клеточной физиологии микробных сообществ. Основное преимущество этой процедуры заключается в том, что оптимизированный протокол флуоресцентного зонда может различать физиологические состояния цианобактерий на уровне отдельных клеток в режиме реального времени.
Демонстрировать эту процедуру будет Дэвид Хартнелл, аспирант, работающий в лаборатории цитометрии в Борнмутском университете. Перед началом эксперимента поместите пустую гемолизную трубку на зонд для инъекции образца. Нажмите «Очистить».
А затем провести обратную промывку, чтобы начать процесс очистки проточной цитометрии. В конце обратной промывки загрузите новую гемолизную трубку, содержащую два миллилитра ультрачистой отфильтрованной воды, в зонд для впрыска образца или SIP и установите ограничение по времени от 10 до 15 минут, а скорость жидкости — быструю. Затем выберите новую ячейку данных и установите соответствующие пороги флуоресценции и рассеяния света для уменьшения фонового шума.
Затем нажмите «Выполнить». Если общее количество событий в секунду не меньше рекомендованного производителем, запустите два миллилитра обеззараживающего раствора в течение двух минут на быстром. И повторите шаги обратной промывки и промывки сверхчистой водой.
Для приготовления первичной монокультуры M.aeruginosa в автоклаве 98 миллилитров ультрачистой фильтрованной воды, смешанной с двумя миллилитрами водорослевой среды, в стакане объемом 250 миллилитров в течение 20 минут при температуре 120 градусов Цельсия. Когда культура находится в высоком устойчивом состоянии плотности, дезагрегируйте два миллилитра клеток с помощью вортекса. А затем перенести клетки под зонд для введения образца.
Подтвердите равномерное распределение клеток с помощью световой микроскопии. Затем выберите график гистограммы в программном обеспечении проточного цитометра, чтобы записать данные прямого рассеяния света. И нажмите кнопку Log, чтобы просмотреть данные в масштабе журнала по оси X.
В отдельном выходе установите еще одну гистограмму логарифмической оси, чтобы записать естественную флуоресценцию клеток M.aeruginosa. Далее выберите источник света, способный возбуждать фикоцианин, и детектор, способный фильтровать излучения от образующейся флуоресценции. Для записи в самом высоком разрешении выберите настройки, наиболее близкие к размеру ядра целевого организма.
И установите относительно медленный расход. Перед получением данных установите пороговое значение для подавления любых сигналов рассеяния света и флуоресценции, вызванных электронным фоновым шумом или мусором образца клетки. Затем выберите новую ячейку данных.
Создайте график плотности с параметрами прямого и бокового рассеяния в логарифмической шкале и нажмите кнопку «Выполнить». Теперь примените прямое рассеяние света и естественный флуоресцентный затвор к данным прямого параллельного рассеяния, чтобы исключить любые сигналы рассеяния низкого уровня и включить только более высокие сигналы фикоцианина относительной флуоресценции. Затем собирайте события до тех пор, пока выборка не будет завершена, и используйте данные для определения начального количества ячеек.
Чтобы оптимизировать поглощение молекулярных зондовых клеток, подвергните половину предварительно подготовленной монокультуры воздействию соответствующих условий для создания мертвого контроля. Проверьте изменения в микроокружении образца, чтобы подтвердить гибель культуры. А затем разукрупните образование колоний, как только что продемонстрировано.
Затем выберите 488-нанометровый лазер вместе с детектором, который может регистрировать флуоресценцию от зеленого и оранжевого зондов нуклеиновых кислот. И 640-нанометровый лазер для регистрации сигналов фикоцианина через соответствующие детекторы. В новом техническом описании настройте график плотности с параметрами прямого и бокового рассеяния.
Затем создайте одну гистограмму с использованием соответствующего канала оптического детектора молекулярного зонда. Одна гистограмма для обнаружения выбросов фикоцианина и одна гистограмма для событий прямого рассеяния, все в логарифмической шкале. Проведите отбор проб цианобактерий с использованием различных концентраций и времени инкубации.
Создайте вентиль в гистограмме прямого рассеяния, чтобы включить в нее события только с размером клетки целевого организма. И прикладываем его к соответствующему каналу флуоресцентного зонда. Затем в канале флуоресцентного зонда создайте еще один включающий программный вентиль против самого высокого пика на гистограмме.
И впоследствии забивать соответствующую положительную флуоресценцию зонда на график плотности. Сравните количество сигналов флуоресценции с числом мертвых контрольных клеток, где наибольший процент поглощения клеточного нуклеинового зонда не вызывает неспецифического окрашивания. Для проверки перекрытия флуоресцентной интерференции при собственном или неспецифическом окрашивании клеток выберите 50 процентов живых и 50 процентов мертвых данных смешанных культур.
И снимите люминесцентные затворы. Примените вентиля, чтобы включить в гистограмму фикоцианинового канала только гистограмму прямого рассеяния для размера клеток целевого организма. Закрытие верхних и самых низких пиков фикоцианина и маркировка их как живые и мертвые, соответственно.
Затем отдельно прикладывают затворы к живому и мертвому сигналам фикоцианина. И записать обе средние длины волн. Чтобы определить чувствительность протокола, соотнесите средние длины волн положительного флуоресценции мертвого молекулярного зонда и собственный неспецифический живой сигнал.
Наконец, выберите оптимизированный протокол, в котором было окрашено наибольшее количество мертвых клеток без возникновения неспецифического окрашивания. На этих графиках показаны репрезентативные выходы прямого и бокового рассеяния света для размера клеток и внутренней сложности культуры партии M.aeruginosa в экспоненциальной фазе. Стробирование может быть выполнено путем уточнения данных между определенными точками прямого рассеяния света.
Фикоцианин производит сильный сигнал при опросе красным источником света, который может быть использован для дальнейшего контроля за популяциями, представляющими интерес. От прямого рассеяния света и флуоресцентных сигналов данные могут быть затем стробированы от исходного выходного сигнала до конкретных данных на образце M.aeruginosa для окончательного подсчета клеток. Когда живые элементы с более высокой пигментацией и мертвые элементы с более низкой пигментацией смешиваются, становится очевидным уменьшение сдвига в автофлуоресценции.
В мембранных клетках зонды нуклеиновых кислот производят дополнительный сигнал, который можно наблюдать с помощью проточной цитометрии и в дальнейшем подтверждать с помощью эпифлуоресцентной микроскопии. Флуоресцентная дискриминация между живыми и мертвыми клетками увеличивается со временем между 0,05 и 0,5 микромолярными концентрациями, но уменьшается между 1 и 100 микромолярными концентрациями для обоих зондов. Действительно, оптимальная концентрация для зонда зеленых нуклеиновых кислот составляет 0,5 микромоляра с временем инкубации 30 минут.
Для зонда оранжевых нуклеиновых кислот оптимальная концентрация составляет один микромоляр для 10-минутной инкубации. После освоения для каждого молекулярного зонда оптимизация может быть завершена за день, если она выполнена правильно. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить о хранении зондов в стабильной среде, при соответствующей температуре, pH и освещенности.
После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области микробиологии к изучению гетерогенности сообществ в фитопланктоне. Посмотрев видео, вы теперь должны хорошо понимать, как разработать оптимальный протокол оценки клеточной физиологии с помощью проточной цитометрии и молекулярных зондов. Не забывайте, что работа с молекулярными зондами и токсичными организмами может быть чрезвычайно опасной, и что при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение соответствующего P.P.E. и полное понимание материалов COSHH.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
Это исследование представляет протокол для анализа физиологических состояний цианобактерий с использованием проточной цитометрии и молекулярных зондов. Метод направлен на точное определение смертности клеток в микробных популяциях, решая проблемы гетерогенности клеток.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Микробиология
- Клеточная биология
- Проточная цитометрия
Предыстория
- Микробные популяции демонстрируют значительную гетерогенность клеток.
- Проточная цитометрия может оценивать физиологические состояния, но результаты варьируются по видам.
- Точное измерение смертности клеток важно для понимания микробных сообществ.
- Оптимизированные флуоресцентные зонды могут улучшить анализ на уровне отдельной клетки.
Цель исследования
- Разработать надежный протокол для оценки физиологии цианобактерий.
- Повысить точность определения смертности клеток.
- Облегчить анализ физиологических состояний цианобактерий в реальном времени.
Использованные методы
- Проточная цитометрия для анализа клеток.
- Молекулярные зонд для различения физиологических состояний.
- Оптимизация протокола для точных результатов.
- Демонстрация аспирантом в лаборатории цитометрии.
Основные результаты
- Протокол эффективно различает физиологические состояния у цианобактерий.
- Было достигнуто точное определение смертности клеток.
- Анализ в реальном времени дал представление о поведении микробов.
- Результаты поддерживают понимание популяций цианобактерий.
Выводы
- Разработанный протокол улучшает анализ физиологии цианобактерий.
- Он устраняет предыдущие ограничения в измерении смертности клеток.
- Этот метод может быть применен к различным микробиологическим исследованиям.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Accurate assessment of cellular viability in microbial systems supports early-stage target validation by enabling reliable phenotypic screening and mechanistic de-risking. Flow cytometry with optimized molecular probes provides quantitative, single-cell resolution data that improves predictive confidence in lead identification campaigns. This approach addresses heterogeneity challenges in discovery biology, facilitating data-driven go/no-go decisions and reducing late-stage biological risk in antimicrobial or anti-infective pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by distinguishing viable from non-viable cells in microbial populations.
- Operational Value: Supports functional target validation through membrane integrity assessment using SYTOX Green and SYTOX Orange probes.
- Predictive Value: Optimized probe concentrations (0.5 µM green, 1.0 µM orange) minimize false negatives and non-specific staining, enhancing assay reliability.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, reproducible fluorescence readouts for high-throughput compound screening in antimicrobial discovery.
- Quantitative Output: Enables precise measurement of probe uptake as a dependent variable for dose-response modeling.
- Scalability: Protocol optimization in Microcystis aeruginosa provides a transferable framework for other cyanobacterial or microbial systems.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Supports preclinical modeling of antimicrobial efficacy by quantifying compound-induced mortality in target pathogens.
- Translational Continuity: Connects discovery-phase viability screening to preclinical validation through consistent, flow cytometry-based endpoints.
- Risk-Adjusted Advancement: Reduces mechanistic ambiguity in lead optimization by providing real-time, single-cell physiological data.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification, providing mechanistic insights that inform compound progression decisions.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification by correlating compound treatment with changes in cellular viability.
- Screening: Delivers assay standardization and reproducibility through optimized probe incubation and concentration parameters.
- Analytics: Generates quantitative fluorescence measurements enabling statistical comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Supports biomarker alignment by linking membrane integrity readouts to compound mechanism of action.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable cytometry platform applicable across microbial targets in anti-infective programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing false viability readings through probe optimization.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization across laboratories via defined probe concentrations and incubation times.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of compounds lacking target-specific activity.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by identifying compounds with genuine antimicrobial effects versus assay artifacts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry operation and fluorescence compensation for multi-parameter detection.
- Dependent on access to flow cytometers with 488 nm laser compatibility and appropriate detection channels for SYTOX dyes.
- Necessitates cross-team protocol standardization to ensure consistent probe handling, storage, and application.
- Involves adaptation considerations when transferring the method to Gram-positive or Gram-negative bacterial models.
- Includes practical limitations such as probe toxicity and the need for biosafety containment when working with toxic organisms like Microcystis aeruginosa.
