Молекулярная зонд Оптимизация для определения клеток смертности в фотосинтезирующих организмов (
29 января 2016 г.
Микробные популяции содержат значительное гетерогенность клеток, которые могут диктовать общее поведение. Анализ молекулярной зонд через проточной цитометрии можно определить физиологические состояния клеток, однако его применение зависит от вида. Это исследование обеспечивает протокол точно определить сотовый смертности в популяции цианобактерии, не преуменьшая или записи ложные положительные результаты.
Общая цель данной процедуры — продемонстрировать способ разработки протокола, позволяющего эффективно анализировать физиологическое состояние цианобактерий с помощью проточной цитометрии и молекулярных зондов. Этот протокол может помочь ответить на ключевые вопросы о физиологии клеток микробных сообществ. Основным преимуществом данной процедуры является то, что оптимизированный протокол использования флуоресцентных зондов позволяет в режиме реального времени различать физиологические состояния цианобактерий на уровне отдельных клеток.
Эту процедуру продемонстрирует Дэвид Хартнелл, аспирант, работающий в лаборатории цитометрии Университета Борнмута. Перед началом эксперимента поместите пустую пробирку для гемолиза на зонд для ввода образца. Нажмите кнопку «unclog» (прочистка).
Затем выполните обратную промывку, чтобы начать процесс очистки проточного цитометра. По завершении обратной промывки установите на зонд для ввода образца (SIP) новую пробирку для гемолиза, содержащую 2 мл ультрачистой фильтрованной воды, установите ограничение по времени от 10 до 15 минут, а скорость потока — на «быструю» (fast). Далее выберите новую ячейку данных и установите соответствующие пороги флуоресценции и светорассеяния для снижения уровня фонового шума.
Затем нажмите кнопку запуска. Если общее количество событий в секунду не ниже рекомендуемого производителем значения, пропустите два миллилитра деконтаминирующего раствора в течение двух минут в режиме fast. После этого повторите этапы обратной промывки и промывки ультрачистой водой.
Для подготовки первичной монокультуры M.aeruginosa в стакане объемом 250 мл автоклавируйте 98 мл ультрачистой фильтрованной воды, смешанной с двумя миллилитрами алгоритмической среды, в течение 20 минут при 120 °C. Когда культура достигнет высокой стационарной плотности, дезагрегируйте два миллилитра клеток путем вортексирования. Затем перенесите клетки под зонд для ввода образца.
С помощью световой микроскопии убедитесь, что клетки распределены равномерно. Затем в программном обеспечении проточного цитометра выберите гистограмму для записи данных о прямом светорассеянии. Нажмите log, чтобы отобразить данные по оси x в логарифмическом масштабе.
В отдельном окне вывода установите еще одну гистограмму с логарифмической осью для регистрации естественной флуоресценции клеток M.aeruginosa. Затем выберите источник света, способный возбуждать фикоцианин, и детектор, который может фильтровать излучение результирующей флуоресценции. Для записи с максимально возможным разрешением выберите настройки, максимально близкие к размеру ядра целевого организма.
Установите относительно низкую скорость потока. Перед сбором данных установите порог, чтобы отсечь сигналы светорассеяния и флуоресценции, вызванные электронным фоновым шумом или дебрисом клеточного образца. Затем выберите новую ячейку данных.
Постройте график плотности по параметрам прямого и бокового светорассеяния в логарифмическом масштабе и нажмите кнопку запуска. Теперь примените гейт по прямому светорассеянию и естественной флуоресценции к данным прямого и бокового рассеяния, чтобы исключить сигналы с низким уровнем рассеяния и оставить только сигналы с более высокой относительной флуоресценцией фикоцианина. Затем собирайте события до завершения анализа образца и используйте полученные данные для определения исходного количества клеток.
Для оптимизации поглощения молекулярного зонда клетками подвергните половину ранее подготовленной монокультуры воздействию соответствующих условий для создания отрицательного контроля (мертвых клеток). Проверьте изменения в микроокружении образца, чтобы подтвердить гибель культуры. Затем проведите дезагрегацию колоний, как было продемонстрировано ранее.
Затем выберите лазер с длиной волны 488 нм и детектор, способный регистрировать флуоресценцию зеленых и оранжевых зондов для нуклеиновых кислот. Также выберите лазер с длиной волны 640 нм для регистрации сигналов фикоцианина через соответствующие детекторы. В новом листе данных настройте график плотности (density plot) с параметрами прямого и бокового светорассеяния.
Затем создайте гистограммы, используя соответствующие каналы оптических детекторов молекулярных зондов: одну гистограмму для регистрации излучения фикоцианина и одну для событий прямого светорассеяния, при этом для обеих используйте логарифмическую шкалу. Проанализируйте образцы цианобактерий с различными концентрациями и временем инкубации.
Создайте гейт на гистограмме прямого светорассеяния, чтобы выделить события, соответствующие размеру клеток целевого организма, и примените его к соответствующему каналу флуоресцентного зонда. Затем в канале флуоресцентного зонда создайте еще один объединяющий программный гейт вокруг самого высокого пика на гистограмме.
Затем нанесите гейт на соответствующую положительную флуоресценцию зонда на плот плотности. Сравните количество флуоресцентных сигналов с количеством клеток отрицательного контроля (мертвых клеток), чтобы определить максимально допустимый процент поглощения нуклеинового зонда клетками, который не приводит к неспецифическому окрашиванию. Для проверки перекрытия флуоресцентных сигналов, вызванного собственным или неспецифическим окрашиванием клеток, используйте данные смешанной культуры, состоящей из 50% живых и 50% мертвых клеток.
Затем удалите флуоресцентные гейты. Установите гейты так, чтобы включить только гистограмму прямого светорассеяния, соответствующую размеру клеток целевого организма, на гистограмме канала фикоцианина. Выделите гейтами самые высокие и самые низкие пики фикоцианина, обозначив их как «живые» и «мертвые» соответственно.
Затем отдельно примените гейты к сигналам фикоцианина живых и мертвых клеток. Запишите оба значения средних длин волн. Для определения чувствительности протокола рассчитайте отношение средних длин волн флуоресценции положительного мертвого молекулярного зонда и собственного неспецифического сигнала живых клеток.
Наконец, выберите оптимизированный протокол, при котором окрашено максимальное количество мертвых клеток без появления неспецифического окрашивания. На данных графиках представлены репрезентативные показатели прямого и бокового светорассеяния, отражающие размер клеток и внутреннюю сложность батч-культуры M.aeruginosa в экспоненциальной фазе. Гейтирование можно выполнить путем уточнения данных между определенными точками выходного сигнала прямого светорассеяния.
Фикоцианин дает сильный сигнал при воздействии источника красного света, что может быть использовано для дальнейшего гейтирования интересующих популяций. На основании данных прямого светорассеяния и флуоресцентных сигналов можно провести гейтирование исходных выходных данных для получения специфических данных по образцу M.aeruginosa для окончательного подсчета клеток. При смешивании живых контрольных образцов с более выраженной пигментацией и мертвых с менее выраженной пигментацией становится очевидным сдвиг в сторону снижения автофлуоресценции.
В клетках с поврежденной мембраной зонды к нуклеиновым кислотам создают дополнительный сигнал, который можно наблюдать с помощью проточной цитометрии и дополнительно подтвердить методом эпифлуоресцентной микроскопии. Флуоресцентная дифференциация между живыми и мертвыми клетками увеличивается со временем при концентрациях от 0,05 до 0,5 micromolar, но снижается при концентрациях от 1 до 100 micromolar для обоих зондов. Таким образом, оптимальной концентрацией для зеленого зонда к нуклеиновым кислотам представляется 0,5 micromolar при времени инкубации 30 минут.
Для оранжевого зонда к нуклеиновым кислотам оптимальной концентрацией является 1 µM при 10-минутной инкубации. При наличии соответствующего опыта оптимизация для каждого молекулярного зонда может быть завершена за один день, если процедура проводится правильно. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости содержания зондов в стабильной среде, при соблюдении соответствующих температурного режима, pH и условий освещения.
После своей разработки этот метод открыл исследователям в области микробиологии путь к изучению гетерогенности сообществ фитопланктона. После просмотра видео у вас должно появиться четкое понимание того, как разработать оптимальный протокол для оценки физиологии клеток с помощью проточной цитометрии и молекулярных зондов. Не забывайте, что работа с молекулярными зондами и токсичными организмами может быть крайне опасной, и при выполнении данной процедуры необходимо всегда соблюдать меры предосторожности, такие как использование соответствующих средств индивидуальной защиты и полное ознакомление с материалами COSHH.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлен протокол анализа физиологических состояний цианобактерий с помощью проточной цитометрии и молекулярных зондов. Метод направлен на точное определение смертности клеток в микробных популяциях, что позволяет решить проблему гетерогенности клеток.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Микробиология
- Клеточная биология
- Проточная цитометрия
Теоретические сведения
- Микробные популяции демонстрируют значительную гетерогенность клеток.
- Проточная цитометрия позволяет оценивать физиологическое состояние, но результаты варьируют в зависимости от вида.
- Точное измерение гибели клеток имеет решающее значение для понимания микробных сообществ.
- Оптимизированные флуоресцентные зонды позволяют улучшить анализ на уровне отдельных клеток.
Цель исследования
- Разработка надежного протокола для оценки физиологии цианобактерий.
- Повышение точности определения смертности клеток.
- Облегчение анализа физиологических состояний цианобактерий в режиме реального времени.
Используемые методы
- Проточная цитометрия для анализа клеток.
- Молекулярные зонды для дифференциации физиологических состояний.
- Оптимизация протокола для получения точных результатов.
- Демонстрация аспирантом в лаборатории цитометрии.
Основные результаты
- Данный протокол позволяет эффективно дифференцировать физиологические состояния цианобактерий.
- Было достигнуто точное определение гибели клеток.
- Анализ в режиме реального времени позволил получить представление о поведении микроорганизмов.
- Результаты способствуют пониманию особенностей популяций цианобактерий.
Выводы
- Разработанный протокол расширяет возможности анализа физиологии цианобактерий.
- Он устраняет прежние ограничения при измерении смертности клеток.
- Данный метод может быть применен в различных микробиологических исследованиях.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Точная оценка жизнеспособности клеток в микробных системах способствует валидации мишеней на ранних этапах, обеспечивая надежный фенотипический скрининг и снижение механистических рисков. Проточная цитометрия с оптимизированными молекулярными зондами предоставляет количественные данные с разрешением на уровне отдельных клеток, что повышает прогностическую достоверность при поиске перспективных соединений-лидеров. Данный подход позволяет решить проблему гетерогенности в биологических исследованиях, облегчая принятие обоснованных решений о продолжении или прекращении разработки и снижая биологические риски на поздних стадиях создания противомикробных или противоинфекционных препаратов.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем дифференциации жизнеспособных и нежизнеспособных клеток в микробных популяциях.
- Практическая ценность: обеспечивает функциональную валидацию мишеней посредством оценки целостности мембран с использованием зондов SYTOX Green и SYTOX Orange.
- Прогностическая ценность: оптимизированные концентрации зондов (0.5 µM зеленого, 1.0 µM оранжевого) минимизируют количество ложноотрицательных результатов и неспецифического окрашивания, повышая надежность анализа.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: обеспечивает получение стандартизированных, воспроизводимых показателей флуоресценции для высокопроизводительного скрининга соединений при поиске антимикробных средств.
- Количественный выход: позволяет точно измерять поглощение зонда как зависимую переменную для моделирования зависимости «доза-эффект».
- Масштабируемость: оптимизация протокола на Microcystis aeruginosa создает переносимую основу для других цианобактериальных или микробных систем.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для исследования заболеваний: Обеспечивает доклиническое моделирование антимикробной эффективности путем количественного определения вызванной соединением смертности целевых патогенов.
- Трансляционная преемственность: Связывает скрининг жизнеспособности на этапе поиска с доклинической валидацией с помощью согласованных конечных точек на основе проточной цитометрии.
- Прогресс с учетом рисков: Снижает механистическую неопределенность при оптимизации ведущих соединений, предоставляя физиологические данные на уровне отдельных клеток в режиме реального времени.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Этот метод интегрируется в процесс поиска новых лекарственных средств — от валидации мишени до идентификации соединений-лидеров, предоставляя данные о механизмах действия, которые позволяют принимать обоснованные решения о дальнейшем продвижении соединений.
- Открывающая биология: Облегчает проверку гипотез и уточнение путей передачи сигналов путем сопоставления воздействия соединений с изменениями жизнеспособности клеток.
- Скрининг: Обеспечивает стандартизацию и воспроизводимость анализа за счет оптимизации параметров инкубации и концентрации зондов.
- Аналитика: Позволяет получать количественные измерения флуоресценции для статистического сравнения экспериментальных условий.
- Трансляционные исследования: Способствует согласованию биомаркеров путем связы за показателей целостности мембран с механизмом действия соединений.
- Корпоративное повторное использование: Создает универсальную платформу цитометрии, применимую для различных микробных мишеней в рамках антиинфекционных программ.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов при валидации мишеней за счет снижения количества ложноположительных показателей жизнеспособности путем оптимизации зондов.
- Операционная ценность: улучшает воспроизводимость и стандартизацию в различных лабораториях благодаря определению концентраций зондов и времени инкубации.
- Стратегическая ценность: повышает эффективность использования капитала, позволяя на ранних этапах отсеивать соединения, не обладающие мишень-специфической активностью.
- Влияние на портфель: позволяет осуществлять приоритизацию с учетом рисков путем дифференциации соединений с истинным антимикробным действием от артефактов анализа.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с проточной цитометрией и компенсацией флуоресценции для многопараметрического детектирования.
- Зависит от наличия доступа к проточным цитометрам, совместимым с лазером 488 нм, и имеющим соответствующие каналы детектирования для красителей SYTOX.
- Необходима стандартизация протоколов между исследовательскими группами для обеспечения единообразия при работе с зондами, их хранении и применении.
- Потребуется адаптация метода при его переносе на модели грамположительных или грамотрицательных бактерий.
- Включает такие практические ограничения, как токсичность зондов и необходимость соблюдения мер биологической безопасности при работе с токсичными организмами, такими как Microcystis aeruginosa.
