Photopatterning белки и клетки в водной среде, используя TiO

Общая цель следующего эксперимента заключается в проведении модификации поверхности каркаса для культуры клеток с использованием фотокаталитической активности диоксида титана. Это достигается путем нанесения тонкого слоя диоксида титана на стеклянную покровную пластинку с последующим покрытием октадецилсиланом для придания всей поверхности гидрофобности. На втором этапе субстрат блокируют путем погружения в среду для культуры клеток, содержащую сывороточный альбумин.

Альбумин адсорбируется на поверхности, делая ее непригодной для адгезии клеток. Затем образец переносят в водный раствор, содержащий коллаген, после чего поверхность облучают сфокусированным УФ-светом. Это позволяет молекулам коллагена селективно адсорбироваться в облученном участке, делая эту область пригодной для адгезии клеток.

Этот процесс можно повторять для создания паттернов из нескольких белков или типов клеток. В данном видео мы демонстрируем, как адгезивная область клеток PC 12 может быть селективно модифицирована с помощью УФ-облучения. Впервые идея этого метода появилась у нас, когда мы осознали, что фотокатализ на основе диоксида титана применяется в коммерческих самоочищающихся стеклах, которые удаляют органические загрязнения с поверхности при воздействии света; этот эксперимент будет проводиться совместно со студентом-аспирантом из моей лаборатории.

Начните с того, что пронумеруйте покровные стекла с помощью алмазного резака таким образом, чтобы можно было определить, какой стороной образец обращен вверх. Затем очистите покровные стекла: сначала под проточной дважды дистиллированной водой, затем, погрузив их в раствор «пиранха» на 10 минут. По истечении 10 минут восемь раз промойте покровные стекла дважды дистиллированной водой и высушите их потоком азота.

Затем установите мишень из оксида титана в систему высокочастотного магнетронного распыления, закрепите чистые покровные стекла на держателе образцов с помощью полиамидной ленты, поместите держатель образцов в камеру распыления и откачайте воздух из камеры до достижения давления 2.0 × 10⁻⁴ Па. Затем подайте в камеру аргон и установите давление осаждения на уровне 4.0 мТорр, оставив заслонку закрытой. Постепенно увеличьте ВЧ-мощность до 70 Вт.

Затем откройте заслонку и проводите распыление в течение 15 минут для получения пленки толщиной от 120 до 150 нанометров. Начните с просушки стеклянного стакана и пинцета в печи при температуре 120 °C в течение 30 минут. Затем поместите покровные стекла в плазменный реактор и обработайте поверхность диоксида титана кислородной плазмой в течение пяти минут при мощности 200 Вт и потоке кислорода 100 стандартных кубических сантиметров в минуту для создания более гидрофильной поверхности.

Затем извлеките образцы и погрузите их в дважды дистиллированную воду, чтобы подтвердить супергидрофильность поверхности, после чего тщательно высушите поверхность потоком азота. Далее переместите образцы, сухой стакан и пинцет в перчаточный пакет, заполненный азотом, и приготовьте 1 мМ раствор октадецилтрихлорэтилена в толуоле. Погрузите образец в раствор на один час при комнатной температуре для формирования самоорганизующегося монослоя на поверхности оксида титана.

Затем удалите любые молекулы фазора, промывая образец в толуоле, ацетоне, этаноле и, наконец, в дважды дистиллированной воде в течение пяти минут для каждого растворителя. После этого промойте образец четыре раза в свежей дважды дистиллированной воде и высушите поверхность в потоке азота.

Стерилизуйте покрывные стекла с нанесенным слоем, погрузив образцы в 70% ethanol на пять минут. Затем дважды промойте образцы стерильной дважды дистиллированной водой. После этого поместите образец в чашку диаметром 35 мм и добавьте 2 мл среды для выращивания PC 12.

Инкубируйте образцы в течение как минимум трех часов в CO2-буферном инкубаторе при 37 °C, чтобы сывороточный альбумин в среде успел адсорбироваться на поверхности покровных стекол. Подготовьте инвертированный флуоресцентный микроскоп, сначала включив дуговую лампу. Затем установите УФ-фильтр-куб и переключите объектив на увеличение 20 x.

Измерьте интенсивность света с помощью измерителя интенсивности УФ-излучения и рассчитайте время облучения для дозы 200 joules per square centimeter. Затем, используя предметный микрометр, установите диаметр облучаемой области на 200 microns, отрегулировав полевую диафрагму. После трехчасовой инкубации добавьте в среду, покрывающую покровные стекла, 200 µL коллагена IV типа в концентрации 3.0 mg/mL.

Затем перенесите чашку диаметром 35 мм на предметный столик микроскопа и с помощью рисок-отметок настройте фокус микроскопа на поверхность образца. Облучите область покровного стекла УФ-светом с дозой 200 Дж/см². Затем замените среду на 2 мл свежей ростовой среды с NGF, но без коллагена IV типа, и поместите образец обратно в инкубатор.

Соберите культивируемые клетки PC 12, дифференцированные под воздействием NGF, в коническую пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте пробирку при 150 ×g в течение четырех минут. Затем аспирируйте супернатант и добавьте один миллилитр ростовой среды. Ресуспендируйте клетки, осторожно перемешивая их пипеткой вверх-вниз, используя гемоцитометр.

Подсчитайте плотность клеток и добавьте 3,0 × 10⁵ клеток в чашку диаметром 35 мм, содержащую модифицированные покровные стекла. Инкубируйте чашку от одного до двух дней в инкубаторе с 5% CO2 при 37 °C после одного-двух дней культивирования на модифицированной поверхности XC2. С помощью микроскопа убедитесь, что клетки прикрепляются и растут только в облученном УФ-излучением регионе покровных стекол.

Затем добавьте 67 мкл коллагена IV типа в чашку с культивируемыми клетками так, чтобы конечная концентрация коллагена составила 100 мкг/мл, при этом микроскоп должен быть настроен для создания поверхностного паттерна. Поместите чашку на предметный столик микроскопа и расположите область облучения рядом с текущим местоположением клеток. Облучите покровное стекло УФ-светом с дозой 200 Дж/см².

После облучения замените среду на среду без содержания коллагена и поместите образец обратно в инкубатор, стараясь завершить обработку одного образца в течение 30 минут. На данном изображении, полученном с помощью поперечного сканирующего электронного микроскопа, представлена нанесенная методом магнетронного распыления пленка диоксида титана. На основании наблюдений толщина пленки была оценена примерно в 150 nanometers.

Также здесь заметна гладкость осажденной пленки диоксида титана. Дальнейший анализ с помощью атомно-силовой микроскопии показал, что среднеквадратичная шероховатость поверхности составляла всего 0.2 нм. Коллаген четвертого типа и раствор адсорбируются преимущественно в области облучения УФ-излучением, где лазер вытесняет альбумины.

Чтобы продемонстрировать универсальность данного подхода, с помощью этой же методики были нанесены паттерны других белков, таких как фибрин. Здесь клетки растут на области паттерна XC two покровного стекла, а также непосредственно рядом с ними — в зоне, ограниченной пунктирной линией. Покровное стекло было подвергнуто УФ-облучению in situ two и покрыто коллагеном четвертого типа.

В течение следующих пяти дней клетки пролиферируют и мигрируют, заполняя заново закодированную область. Описанная здесь процедура может быть использована для произвольного манипулирования культивируемыми клетками и потенциально для создания паттернов из нескольких типов клеток с целью построения сложных систем совместного культивирования.