Изучение белка функции и роль Altered экспрессии белка с помощью интерференции антител и трехмерных реконструкций

Общая цель данного эксперимента заключается в эффективном и строго контролируемом изучении функций белка и роли измененной экспрессии белка. Это достигается за счет применения антител для уменьшения количества функционального белка, доступного клетке. Для этого антитела связываются с пептидом под названием Chariot, который опосредует прохождение через клеточные мембраны.

Затем представляющие интерес клеточные структуры визуализируются и реконструируются с помощью 3D-графики для оценки эффектов лечения. Результаты показывают, что пептиды Chariot особенно хорошо подходят для мишеней на ядерные белки путем интерференции антител. Основные преимущества этого метода по сравнению с существующими методами, такими как РНК-интерференция, заключаются в том, что антитела, переносимые в клетку, эффективны немедленно, и что исследователь может строго контролировать степень интерференции, регулируя дозировку антител.

Хотя этот метод может дать представление о функциях белков во многих типах клеток, он особенно интересен для нацеливания на белки в первичных нейронных культурах, которые очень чувствительны к лечению, но очень хорошо переносят Chariot. При приготовлении ресуспендируйте порошок лиофилизированного пептида Chariot в стерильной воде в количестве двух микрограммов на микролитр. Осторожно постучите по тюбику, чтобы смешать порошок с раствором.

Затем подготовьте небольшие рабочие аликвоты, всего по два микролитра на каждую реакцию, и храните аликвоты при температуре 20 градусов Цельсия. Далее подготовьте клетки млекопитающих к трансфекции, засеяв их в 24-луночный планшет половиной миллилитра среды, содержащей антибиотики. При использовании нейронов засевайте клетки только в двух центральных рядах и с низкой плотностью.

Пустые колодцы пригодятся позже. Поторопитесь. Культивируемые нейроны не должны находиться вне инкубатора более чем на несколько минут.

До тех пор, пока нейроны не достигнут желаемой стадии развития, меняйте от четверти до половины их среды два раза в неделю. Ненейрональные культуры следует использовать, когда клетки находятся на 50% конфлюенции. Для шести тестов и шести контрольных образцов показана следующая процедура.

Для каждого груза приготовьте разведение от 0,1 до 2 микрограмм в 50 микролитрах 1X PBS на пробу. В качестве груза могут быть использованы и высокомолекулярные комплексы предварительно связанных первичных и вторичных антител. Смешайте раствор с помощью слабого вихря, после чего следует кратковременное центрифугирование.

Затем разведите два микролитра стокового раствора Chariot в 50 микролитрах PBS для каждой реакции. Используйте отдельные пробирки для каждого образца, чтобы не допустить самоассоциации Chariot. Теперь соедините подготовленные белки в разведениях Chariot.

Смешайте и закрутите объединенные белки. Инкубируйте образец в течение 30 минут при комнатной температуре, чтобы дать возможность сформировать грузовые комплексы Chariot. Оптимальное количество белковых пептидов зависит от груза и типа используемых клеток.

Поэтому эту сумму следует определять опытным путем. Предварительно подогрейте некоторую питательную среду без добавок, а также 1X PBS, содержащую 0,5 миллимоляра хлорида магния и хлорида кальция до 37 градусов Цельсия. Теперь, для начала, разведите приготовленные комплексы Chariot со 100 микролитрами среды.

Удалите среду из покрытых камер и переложите в пустые лунки для повторного использования. Затем аккуратно промойте клетки 500 микролитрами предварительно подогретого раствора 1X PBS, кальция, хлорида магния. Нанесите среду, несущую комплексы Chariot, на клетки и осторожно покачивайте пластину, чтобы обеспечить равномерное распределение раствора.

Быстро верните клетки в инкубатор и подождите час, прежде чем приступать. Для нейронов после часа инкубации перенесите сохраненные среды в лунки. Для всех остальных клеток добавьте сыворотку до конечной концентрации 10%Культивируемые нейроны очень чувствительны, например, к изменениям температуры среды и pH.

Поэтому эти клетки следует промыть и аккуратно трансфицировать предварительно подогретыми растворами и как можно скорее вернуть в инкубатор. Продолжайте инкубацию столько, сколько потребуется, в зависимости от трансфицированного груза и типа клетки. После инкубации обработайте клетки для последующих анализов в обычном режиме.

Протоколы фиксации, а также живая визуализация совместимы с этим методом. Используя лазерный сканирующий микроскоп с объективом 63X, делайте снимки на расстоянии примерно от 0,25 до 0,5 микрона, чтобы получить Z-стеки с достаточной детализацией при этом избегая обесцвечивания. Точное расстояние между слоями зависит от размера реконструируемой конструкции и должно определяться индивидуально.

Для восстановления изображения откройте файлы LSM в Imaris. В этом программном обеспечении кнопка Escape используется для переключения между выбором и навигацией. Кроме того, можно выбрать несколько объектов, удерживая нажатой клавишу Control.

С помощью настройки дисплея перейдите в каждый канал и отрегулируйте контрастность до тех пор, пока самые яркие структуры не достигнут насыщенности. Эта корректировка не влияет на конструкцию поверхности, но помогает достичь порога изображения. Если восстанавливаемый объект содержится в разных файлах, используйте функцию «Редактировать и добавить срезы» для объединения соответствующих файлов.

Затем нажмите на иконку «Добавить новые поверхности» и выберите «Сегментировать только область интереса». Теперь отрегулируйте поля рамки выделения в соответствии с интересующим объектом. Отрегулируйте форму и наклон прямоугольной формы до тех пор, пока все необходимые конструкции не окажутся внутри коробки.

Выделение должно быть настроено на каждом изображении по всей плоскости Z. Нежелательные объекты могут быть удалены позже. Далее выберите подходящий канал.

Чтобы продолжить, используйте инструмент пороговых значений для восстановления интересующей структуры. Уровень детализации площади поверхности, или диаметр сферы, должен быть установлен в соответствии с реконструируемыми конструкциями. В зависимости от характеристик сигнала может использоваться либо абсолютная интенсивность, либо локальный контраст.

Как правило, локальный контраст лучше работает для диффузных сигналов. Благодаря особенностям этого сигнала, для реконструкции белка внутри ядра используется локальный контраст. В любом случае, настройки нужно корректировать отдельно для каждого интересующего сигнала или структуры.

Завершите реконструкцию, нажав на зеленую стрелку в нижней части экрана. Затем откорректируйте объект с помощью инструмента «Карандаш». Тщательно сравнивайте реконструкции с исходным сигналом, а также вырезайте и удаляйте поверхности, наклоняя изображения по мере необходимости, чтобы инструмент «Вырезать» мог точно выполнять свою задачу.

Теперь измерьте объем, площадь и интенсивность каждой поверхности, выбрав Статистика, Подробная статистика и Средние значения. При необходимости можно создать статистику с цветовой кодировкой, выбрав вкладку Цвет соответствующей поверхности и изменив выбранную опцию с Базовая на Статистически кодированная. С помощью инструмента «Сделать снимок» можно сделать снимки для публикации.

Если необходимо восстановить несколько объектов в одной области, для сохранения информации можно использовать функцию «Сохранить параметры». Симиат, экспрессируемый в клетках HEK293, был специфически обнаружен антителами к симиату, доставленными в клетки пептидами Chariot. После применения комплексы антител Simiate проникают как в сому, так и в ядро, где они специфически локализуются с FLAG-Simiate, как отмечено желтыми стрелками.

Дозозависимым образом, антитела Simiate индуцировали массивный апоптоз в клетках HEK293, в то время как контрольные антитела не оказывали никакого эффекта. Учитывая, что нейронные клетки очень чувствительны к токсическим эффектам, метод был применен к первичным культурам гиппокампа, где не было выявлено влияния на жизнеспособность нейронов при сравнении фиктивных или необработанных клеток и клеток, обработанных Chariot. Следуя той же схеме применения, скопления антител козьей свинки против морского свинки Alexa568 были обнаружены примерно в 83% клеток, где они встречались в соматах, а также в ядрах в разной степени.

Эти наблюдения были дополнительно подкреплены 3D-анализом, который согласуется с результатами, полученными с помощью ячеек HEK293. Следовательно, техника «Колесница» может быть успешно использована для трансфекции диссоциированных первичных нейронов гиппокампа. После освоения этой техники ее можно выполнить за три-шесть часов при правильном выполнении.

Сложное формирование Chariot и интересующего белка занимает около 40 минут. Для трансфекции клеток этими комплексами потребуется 70 минут и дополнительно от одного до четырех часов в зависимости от размеров и свойств груза. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы для более детального анализа функции белка, такие как визуализация в реальном времени и анализы подвижности, анализ и электрофизиологические записи.