Обогащение белков внеклеточного матрикса из тканей и пищеварения в пептидов для анализа масс-спектрометрии

Общая цель этой процедуры заключается в том, чтобы охарактеризовать состав внеклеточных матрик из тканей с помощью масс-спектрометрии. Это достигается путем предварительного разрушения выбранной ткани до тех пор, пока она полностью не станет гомогенизированной. Второй этап включает в себя децеллюляризацию ткани для обогащения белками внеклеточного матрикса с одновременным истощением любых внутриклеточных компонентов.

Затем образец белка, обогащенного ECM, денатурируется на заключительном этапе, образец белка, обогащенного ECM, гликозилируется и расщепляется в пептиды. Западный анализ крови используется для контроля качества децеллюляризации и обогащения белков ВКМ. В конечном счете, анализ пептидов с помощью масс-спектрометрии позволяет охарактеризовать состав ВКМ для этой конкретной ткани.

Этот метод может дать представление о составе внеклеточного матрикса нормальных тканей, но также может быть применен к другим системам, таким как патологические ткани, такие как рак. Для начала подготовьте все буферы, как указано в текстовом протоколе. Таблица первая, включая добавление ингибиторов протеазы.

Затем расщепляют 100 мг ткани в 500 микролитрах буфера С с помощью тканевого гомогенизатора до получения однородной суспензии. Перенесите гомогенат в пробирку с вращателем и инкубируйте в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия в трубе от 10 до 20 микролитров образца в пробирку, помеченную как общий тканевый экстракт или исходный материал вспышки. Заморозьте образец в жидком азоте и храните его при температуре минус 80 градусов Цельсия.

Затем центрифугируйте гомогенат при 16 000 умноженных на G в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия. Соберите надосадочную жидкость в чистую пробирку и пометьте ее как цитозольную или С-фракцию. Вспышка. Заморозьте фракцию C и храните ее при температуре минус 80 градусов по Цельсию.

Пипетка туда. Суспензируйте гранулу в 400 микролитрах буфера в два раза, а затем инкубируйте на трубке ротатора в течение 20 минут при температуре четыре градуса Цельсия. Затем центрифугируйте образец и выбросьте надосадочную жидкость, чтобы сначала извлечь ядерные белки.

Повторно суспендируйте гранулу в 150 микролитрах буфера N и инкубируйте на вращателе трубки в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия. Далее центрифугируют образец и соберут надосадочную жидкость в чистую пробирку. Повторите инкубацию в буфере N после центрирования.

Соедините надосадочную жидкость и обозначьте их как ядерную или N-фракцию. Вспышка. Заморозьте фракцию N для хранения при температуре минус 80 градусов Цельсия. Добавьте 100 микролитров буфера М и ресус, суспензируйте гранулу.

Затем инкубируйте образец на вращателе пробирки в течение 30 минут при температуре четыре градуса Цельсия перед его центрифугированием. Соберите надосадочную жидкость в чистую пробирку и пометьте ее как мембрану или вспышку М-фракции. Заморозьте фракцию М и храните ее при температуре минус 80 градусов по Цельсию.

Повторно суспендируйте гранулу в 200 микролитрах буфера CS путем энергичного пипетирования, а затем инкубируйте образец на ротаторе пробирки в течение 30 минут. При комнатной температуре центрифугируйте образец в течение 30 минут при комнатной температуре, соберите надосадочную жидкость в чистую пробирку и пометьте ее как цитоскелетную фракцию или фракцию CS. Гранула теперь должна быть заметно меньше.

Повторно суспендируйте гранулу в 150 микролитрах буфера С. Перенесите образец в пробирку и инкубируйте его в течение 20 минут при температуре четыре градуса Цельсия. Центрифугируйте в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия и соберите надосадочную жидкость. Затем соедините надосадочную жидкость с супернатантом из буфера CS в пробирке, уже помеченной как цитоскелетная фракция или фракция CS. Вспышка.

Заморозьте фракцию CS и храните ее при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Для промывки пеллеты ресус. Суспензируйте его в 500 микролитрах PBS, а затем инкубируйте на вращателе трубки в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия.

Центрифугируйте пробирку и выбросьте надосадочную жидкость. Постирайте в общей сложности три раза. Для получения обогащенной ЭХМ пеллеты хранят небольшую фракцию ЭХМ для проведения анализа контроля качества по западному блоку эксперимента.

Мгновенно заморозьте фракции в жидком азоте и храните при температуре минус 80 градусов Цельсия. Для начала пищеварения. Во-первых, повторно суспендируйте гранулу, обогащенную ECM, в восьмимолярной мочевине и добавьте раствор Dihi three etol в воду, чтобы получить конечную концентрацию 10 миллимоляров.

Перенесите трубку в инкубатор и встряхивайте ее при 1400 об/мин в течение двух часов при температуре 37 градусов Цельсия. Затем охладите образец до комнатной температуры и добавьте раствор восстановленного йота-ацетамида в воду до конечной концентрации 25 миллимоляров. Выдержите смесь в темноте в течение 30 минут.

При комнатной температуре разбавьте до двух моляров концентрацию мочевины со 100 миллимолярным бикарбонатом аммония, а затем добавьте P PGA F. Перенесите образец в инкубатор и встряхните его при 1400 об/мин в течение двух часов. При температуре 37 градусов Цельсия добавьте эндопротеазу, нарежьте C в смесь и встряхивайте при 1400 об/мин в течение двух часов при 37 градусах Цельсия. Далее добавьте трипсин и встряхните при 1400 об/мин в течение ночи при 37 градусах Цельсия.

Мутный раствор должен стать прозрачным после ночного переваривания на втором грануле трипсина и встряхивать еще два часа, чтобы инактивировать трипсиновую пипетку 50% трифторуксусной кислоты в смесь с шагом в один микролитр до тех пор, пока pH не станет меньше двух. Контролируйте pH, обнаруживая один микролитр пептидного раствора на pH-бумаге. Центрифугируйте раствор в течение пяти минут при комнатной температуре.

Наконец, соберите надосадочную жидкость в чистую пробирку с низким уровнем удержания. Храните пептидный раствор ЭКМ при температуре минус 20 градусов Цельсия. Вестерн-блоттинг в результате децеллюляризации зеркальной легочной ткани показывает экстракцию внутриклеточных компонентов, таких как ASIN бета-1 актин GA, dh и гистоны в промежуточных фракциях.

Эти компоненты практически полностью отсутствуют во фракции ВКМ, хотя некоторые незначительные загрязнения гистонами остаются. Напротив, коллагеновая фракция сильно обогащена фракцией ECM, но не обнаруживается в других фракциях, что позволяет предположить, что коллаген не теряется на промежуточных этапах экстракции. Аналогичные результаты были получены и при карциноме памяти человека.

Ксенотрансплантат коллагена 1 был значительно обогащен фракцией ECM с небольшими потерями фракции CS. Некоторое остаточное загрязнение актина осталось во фракции ВКМ после его разработки. Этот метод проложил путь биологам и клиницистам к исследованию сложности внеклеточного матрикса нормальных и патологических тканей.