Двуствольное и Концентрические Микроэлектроды для измерения внеклеточной Ion сигналов в ткани головного мозга

Общая цель данной процедуры заключается в обнаружении и анализе динамики ионов в внеклеточном пространстве мозговой ткани. Измерение ионных транзиентов осуществляется с помощью ион-селективных микроэлектродов, которые могут быть изготовлены по двухканальной или концентрической конструкции. На первом этапе микроэлектроды калибруют в экспериментальной ванне.

Затем электроды вводят в острые срезы гиппокампа мыши для регистрации; чтобы вызвать внеклеточные сдвиги ионов, подают трансмиттер глутамат или агонист глутамата. Глутамат связывается и открывает ионотропные рецепторы в постсинаптических шипиках, что обеспечивает приток натрия в клетки и выход калия из них. В конечном итоге это приводит к снижению концентрации внеклеточного натрия и повышению концентрации внеклеточного калия, что регистрируется ион-селективными микроэлектродами.

Данный метод применяется для изучения внеклеточной регуляции ионов и индуцированных активностью переходных изменений концентрации железа в мозге. Здесь мы описываем подготовку и калибровку двух типов ион-селективных микроэлектродов. Мы демонстрируем, как их можно использовать в острых срезах тканей мозга для измерения изменений концентрации внеклеточного калия или натрия в ответ на воздействие нейромедиаторов.

Процедуру продемонстрируют Николь Харк и Саймон из моей лаборатории. Для начала процедуры подготовьте стеклянную капиллярную трубку из боросиликатного стекла с нитью, которая будет использоваться в качестве ионочувствительного ствола, и еще одну трубку для последующего использования в качестве контрольного ствола. Затем с помощью двухкомпонентного клея или узкой полоски алюминиевой фольги зафиксируйте длинный и короткий капилляры вместе с обоих концов.

Нагрейте двойной капилляр в печи при 60 °C в течение одного часа для удаления остаточной влаги. После этого храните электроды в эксикаторе до использования. Установите двойной капилляр по центру в вертикальном вытяжном устройстве с поворотным зажимом. Используйте зажим, чтобы предотвратить удлинение капилляра.

Осторожно удерживайте катушку, пока стекло не станет достаточно мягким, чтобы обеспечить горизонтальный поворот револьвера. После охлаждения поверните зажим на 180 градусов и снимите механический разрыв. Примените второй протокол нагрева для вытягивания капилляра, чтобы получить два острых двухканальных капилляра.

Диаметр кончика двойного капилляра должен быть близок к одному микрону. Теперь заполните контрольный канал до самого кончика дистиллированной водой для предотвращения колонизации. В соответствии со следующей процедурой, поместите двухканальный капилляр кончиком вверх на специально изготовленный держатель.

Затем поместите этот держатель на бутылку с широким горлышком, содержащую предварительно нагретый HMDS, и инкубируйте в течение 70 минут. После этого перенесите капилляр на металлическую подставку. Затем поместите его в предварительно разогретую печь на два часа для просушивания обоих каналов после колонизации; храните капилляр в эксикаторе до использования.

В день проведения эксперимента подготовьте ион-селективный электрод, заполнив кончик силиконизированного ствола от двух до трех µL ион-селективного сенсора. Затем заполните ствол 100 мM хлорида натрия для натрий-селективного микроэлектрода или 100 мM физиологическим раствором хлорида калия для калий-селективного микроэлектрода. Будьте осторожны, чтобы в процессе данной процедуры не попали дополнительные пузырьки воздуха.

Если процесс завершился успешно и сенсор заполнен правильно, поверхность сенсора должна выглядеть как четко видимая вогнутая поверхность на фоне заполняющего раствора. Затем заполните опорный канал, вставьте хлорированные серебряные провода в оба ствола и загерметизируйте каждый ствол стоматологическим воском. В данной процедуре вытяните капилляр длиной два миллиметра в горизонтальном пуллере, чтобы получить короткий конус и диаметр кончика четыре микрона.

Непосредственно перед использованием заполните силиконизированный капилляр 0,2 µL сенсора. Для подготовки внутреннего капилляра вытяните капилляр малого диаметра так, чтобы получилось два капилляра с длинными коническими концами и острыми кончиками. Затем заполните их 100 mM раствором хлорида натрия или 100 mM раствором хлорида калия.

Поместите заполненный датчиком и заполненный физиологическим раствором капилляры в одну линию на специально изготовленный стопор из покровных стекол. Частично вставьте меньший капилляр в больший. Затем зафиксируйте капилляры на другом покровном стекле.

С помощью модельного пластилина перенесите капилляры на предметный столик микроскопа и визуализируйте их при 100-кратном увеличении. С помощью стеклянного стержня, установленного на микроманипуляторе, медленно продвигайте внешний капилляр поверх внутреннего, пока расстояние между их концами не составит примерно пять микрон. Зафиксируйте открытый конец внешнего капилляра на внутреннем капилляре с помощью стоматологического воска и вставьте серебряную проволоку.

Для подготовки электрода сравнения вытяните капилляр с нитью в вертикальном вытягивателе, удалите верхнюю пипетку, затем откройте нижний зажим и приподнимите нижнюю пипетку примерно на пять миллиметров. Снова закройте зажим и поднимайте его до тех пор, пока кончик нижнего электрода не окажется примерно в пяти миллиметрах над нагревательной спиралью. После этого нагрейте спираль и с помощью пинцета согните кончик примерно на 45 градусов в сторону.

Снова согните его примерно на минус 45 градусов, чтобы кончик был направлен параллельно основному стержню. Затем заполните контрольный цилиндр This buffered saline. Вставьте в него хлоридированную серебряную проволоку и загерметизируйте цилиндр стоматологическим воском.

На данном этапе закрепите и ион-селективный, и референтный электроды в микроманипуляторах и опустите их в экспериментальную камеру с перфузией A CSF. Под стереомикроскопом подключите хлоридированные серебряные провода к соответствующим входам головного блока дифференциального усилителя. Затем определите сопротивление электродов.

После этого установите сигналы напряжения на ноль и начните запись для калибровки. После получения стабильной базовой линии перейдите на физраствор, содержащий определенные концентрации измеряемого иона. Затем перенесите срез гиппокампа толщиной 250 мкм в экспериментальную камеру и зафиксируйте его с помощью сетки.

Опустите откалиброванный ион-селективный микроэлектрод на поверхность среза. Затем опустите электрод еще примерно на 50 microns в stratum radiator области CA1. Для введения агониста трансмиттера заполните аппликационную пипетку 0.5 millimolar глутаматом.

Закрепите пипетку в микроманипуляторе и подсоедините ее к устройству подачи давления. Затем опустите аппликационную пипетку в ткань и осторожно расположите ее рядом с кончиком ион-селективного микроэлектрода. Начните подачу давления при значении 40 millibars.

Здесь показано изменение напряжения опорных капилляров двухканального электрода и концентрического электрода в ответ на изменение концентрации натрия в растворе. Также представлены изменения напряжения натриевого потенциала двухканального электрода и концентрического электрода в ответ на изменение концентрации натрия в растворе. На данном рисунке представлен полулогарифмический график зависимости концентрации натрия в растворе от напряжения натриевого потенциала обоих электродов.

Линейные графики показывают наклон около 48 милливольт для обоих электродов. Ниже представлен отклик двухканального и концентрического электродов на быстрое изменение состава раствора. Концентрация натрия изменена с 152 millimolar до 70 millimolar.

Обратите внимание, что время отклика концентрического электрода значительно меньше. На этом рисунке показано переходное изменение внеклеточного натрия, зафиксированное с помощью двухканального и концентрического электродов; кратковременные изменения напряжения в референсных каналах и концентрации внеклеточного натрия были вызваны перфузией ванны 10 мМ аспартата в течение 120 секунд, что отмечено полосой. На данном рисунке переходные изменения напряжения в референсных каналах и концентрации внеклеточного натрия были вызваны локальным давлением 10 мМ глутамата в течение 0,2 секунды.

Обратите внимание, что в данных условиях время отклика конического электрода значительно сокращается. При выполнении этой процедуры важно помнить, что правильное полирование является ключевым этапом успешного изготовления железных селективных микроэлектродов. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как подготавливать и использовать эти электроды для детектирования внеклеточного железа, переходных процессов в тканях мозга.