Протокол для изоляции первичных гепатоцитов человека и соответствующие основные популяциями Non-паренхиматозных клеток печени

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области гепатологии и токсикологии и дать нам возможность для разработки новых моделей печени in vitro и тканевой инженерии. Преимущество этой новой методики заключается в том, что она позволяет изолировать все популяции клеток печени от одного и того же донора и одного и того же небольшого кусочка ткани печени. Чтобы начать эту процедуру, взвесьте только что рассеченную ткань печени в условиях стайлинга и поместите образец ткани печени в ламинарный колпак.

Затем очистите кровь от поверхности образца ткани. Далее промойте канюли с помощью перфузионного раствора 1X. С помощью тканевого клея закрепите оливки канюль в более крупных кровеносных сосудах.

Затем проверьте перфузию и проверьте наличие протечек канюль. Впоследствии закройте все кровеносные сосуды прозрачным 1Х перфузионным раствором, один с тканевым клеем. После этого поместите канюлированный образец ткани печени в воронку Бюхнера.

Затем установите скорость потока перистальтического насоса в диапазоне от 7,5 до 14,6 миллиметров в минуту, в зависимости от количества используемых канюль и сопротивления ткани печени. Перфузируйте ткань до тех пор, пока вся кровь не будет вымыта в течение не менее 20 минут и максимум 30 минут. В некоторых случаях может потребоваться зажать одну из канюль пластиковыми зажимами или увеличить внутреннее давление области путем мягкого надавливания на капсулу печени шпателем с целью оптимизации перфузии.

Полная смена цвета с коричневато-красного на светло-коричневый или светло-желтый свидетельствует о хорошей перфузии. После этого замените перфузионную жидкость на раствор для пищеварения, содержащий коллагеназу P. Затем переставьте установку для этапа пищеварения. Впоследствии выполните круговой поток раствора для сбраживания в течение 15 минут.

Периодически прекращайте перфузию и проверяйте степень пищеварения. Важно, чтобы перфузия раствором для сбраживания была прекращена сразу после того, как образец ткани печени будет достаточно переварен. По готовности достаньте печень из прибора и положите ее в стеклянную посуду.

Промойте образец ткани снаружи ледяным раствором Stop. Удалите канюли из образца ткани печени. Затем с помощью скальпеля откройте образец ткани печени, надрезав середину области, где были прикреплены канюли, и убедитесь, что капсула Глиссона остается неповрежденной.

Промойте образец ткани изнутри, а затем накройте весь образец ткани раствором Stop. Далее осторожно встряхните ткань, чтобы выпустить из нее клетки. Затем соберите клеточную суспензию и отфильтруйте ее через марлевую воронку в 10 50-миллилитровых пластиковых пробирок.

Добавляйте больше Stop Solution в образец ткани печени до тех пор, пока не будет израсходован окончательный объем в 500 миллилитров. После этого центрифугируйте клеточную суспензию, соберите надосадочную жидкость для выделения NPC позже и объедините клеточные гранулы в пластиковые пробирки объемом 250 миллилитров. Впоследствии промойте клеточные гранулы с помощью PBS.

Для этого центрифугируйте клеточную суспензию. Соберите надосадочную жидкость, объедините гранулы и повторно суспендируйте гранулы в среду для инкубации гепатоцитов. Затем определите количество клеток и жизнеспособность в полученной клеточной суспензии с помощью окрашивания трипановым синим.

Чтобы изолировать непаренхиматозные клетки печени, центрифугируйте собранную надосадочную жидкость для устранения оставшихся эритроцитов и гепатоцитов. Соберите надосадочную жидкость и центрифугируйте ее дважды, чтобы получить клеточные гранулы для осаждения HCS, LEC, частично KC и оставшегося KC. Далее повторно суспендируйте гранулы в HBSS. Затем приготовьте градиент плотности 25% и 50%, смешав раствор градиента плотности и PBS для центрифугирования с градиентом плотности.

Аккуратно поместите раствор градиента плотности 25% поверх слоя раствора градиента плотности 50%. Затем осторожно и медленно поместите суспензию NPC поверх слоя градиента плотности 25%, чтобы добиться четкого разделения обоих слоев. Центрифугируйте клеточную суспензию по градиенту плотности без перерыва.

NPC расположены в промежуточной фазе между слоями градиента плотности 25% и 50%. Отсасывайте мертвые клетки и клеточный мусор из самого верхнего слоя и тщательно собирайте интерфазы. После двойного центрифугирования выполните подсчет клеток для KC и фракции MPC.

Затем центрифугируют фракцию NPC с ранее описанной двойной ступенью центрифугирования и ресуспендируют NPC в посевной среде ячейки Купфера. Высевать КС-содержащую фракцию на пластиковые сосуды для культивирования клеток с плотностью пять умно-10 до 5-го КС на квадратный сантиметр. Инкубируйте культуры KC в течение 20 минут в увлажненном инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия 5% углекислого газа.

Первичный КК должен прилипнуть к пластичности клеточной культуры в течение короткого периода времени. Затем соберите надосадочную жидкость, содержащую неадгезивный NPC, состоящий в основном из LEC и HSC. Чтобы отделить ЛЭК от ГСК, начните с центрифугирования надосадочной жидкости.

Затем промойте гранулу PBS. После второго центрифугирования повторно суспендируйте клетки в среде для разделения эндотелиальных клеток звездчатых клеток и выполните подсчет всех оставшихся клеток. Затем повторно суспендируйте 10 миллионов клеток в одном миллилитре среды для разделения эндотелиальных клеток звездчатых клеток.

Затем добавьте 20 микролитров блокирующего раствора из набора MAX и 20 микролитров микрогранул CD31 для иммуномаркировки и инкубируйте полученную суспензию в течение 15 минут при температуре четырех градусов Цельсия. Затем отделите LEC от HSC, как описано в протоколе производителя для системы сортировки с магнитной активацией клеток max и соберите фракцию HSC. Элюируйте магнитно удерживаемые CD31-положительные LEC и суспендируйте их в среде для культуры эндотелиальных клеток звездчатых клеток.

На этих изображениях показаны различные популяции изолят клеток печени непосредственно после процесса выделения в фазово-контрастной микроскопии. В этом наборе изображений представлены изолированные и культивируемые клетки после 24 часов культивирования. Здесь показана характеристика различных клеточных фракций на основе иммунофлуоресценции.

ПГ показала положительные сигналы на маркер гепатоцитов CK18 через 24 часа после выделения, KC был положительным на маркер CD68 через 24 часа после выделения, LEC показал положительные сигналы на виментин через 72 часа после выделения, а HSC был положительным на GFAP через 72 часа после выделения. При проведении этой процедуры важно помнить, что успешное выделение зависит от оптимального переваривания образца ткани печени. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как контролировать пищеварение и как выполнять разделение градиента плотности, что является критически важным этапом этой процедуры.

После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области медицинских исследований к изучению функций и заболеваний печени в недавно созданных культурах клеток in vitro и тканеинженерных моделях печени.