Биомембрана Изготовление растворителем-помощь липидного бислоя (SALB) метод

Общая цель этой процедуры заключается в изготовлении поддерживаемых мембран методом липидного бислоя с помощью растворителя. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области мембранной биологии, такие как понимание фундаментальных свойств липидов и мембранных белков, а также обеспечить такие приложения, как открытие лекарств и молекулярная диагностика. Основное преимущество этого метода заключается в том, что во многих случаях он позволяет изготавливать поддерживающие липиды слоями, что невозможно при использовании обычного метода.

Процедура также проста в использовании и требует минимальной подготовки образцов. Применение этого метода распространяется на нашу терапию и диагностику, поскольку он позволяет изучать важные мишени для лекарств, такие как мембранные белки. Этот метод также может быть использован для изготовления биосовместимых субстратов для материаловедения.

Впервые идея этого метода пришла нам в голову, когда мы обсуждали сложность традиционных методов изготовления мембран, демонстрируя эту процедуру и SHA для постепенных выпускников нашей лаборатории. Приготовьте липидный стоковый раствор из расчета 10 мг на миллилитр липида ДОПК, растворив липидный порошок в растворе изопропанола. Затем растворите меченый липидный порошок DOPE в растворе Изопропанола до получения липидного стокового раствора одного миллиграмма на миллилитр.

Разведите и смешайте исходные растворы в Изопропаноле для получения желаемой липидной смеси в конечной концентрации для флуоресценции, микроскопии и восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания или экспериментов FRAP, в состав липидной смеси следует включить 0,5 вес.% R domine, меченный DOPE. Вводите липидную смесь в изопропаноле в микрофлюидный канал до тех пор, пока он не заполнится. Инкубируйте липидную смесь на поверхности стекла около 10 минут.

Солевой обмен должен производиться при очень низкой скорости потока, в противном случае качество бислоя будет низким. Постепенно заменяйте липидный раствор водой или буферным раствором с помощью перистальтического насоса с очень низким расходом. Затем тщательно промойте канал с избытком буфера, чтобы удалить остаточный изопропанол для образования обогащенных холестерином опорных мембран.

Приготовьте стоковый раствор, содержащий DOPC, липидный холестерин и rho domine, меченный липидом DOPE, сначала растворив соответствующие порошки в изопропаноле, а затем повторив тот же протокол, что и ранее, для проведения анализа текучести мембраны. Сначала погрузите стекло, вставьте 1% раствор сульфата натрия ESAL на 10 минут. Затем горки тщательно вымойте деионизированной водой и промойте этанолом.

Высушите слайды феном, используя слабую струю азота. Затем подвергните предметные стекла воздействию кислородной плазмы в течение 30 секунд при максимальной радиочастотной мощности в кислородной плазменной камере. Далее с помощью пинцета снимите защитное пленочное покрытие бездонной коммерческой микрофлюидной камеры и прикрепите предметное стекло к липкой стороне камеры.

Соберите соединители и трубки на входе и выходе камеры и поместите микрофлюидный канал на предметный столик микроскопа из флуоресцентно меченного поддерживаемого липидного бислоя в микрофлюидном канале, как и раньше, используя желаемую липидную композицию, включающую 0,5 весового процента родомина, меченный неорганическим растворителем DOPE Lipid. Затем найдите двухслойную плоскость с объективом для погружения в масло с 60-кратным увеличением. Чтобы получить изображение, сначала сделайте два предварительных снимка перед фотообесцвечиванием.

Разогревайте лазер до тех пор, пока его интенсивность не станет стабильной. Затем фотоотбеливаем круглое пятно шириной 30 микрон лазерным лучом 532 нанометра 100 милливатт. Сразу после фотоотбеливания.

Делайте серию снимков каждые одну секунду в течение двух минут, чтобы отслеживать восстановление и интенсивность флуоресценции в точке обесцвечивания для количественного определения уровня холестерина. Во-первых, подвергните чип кварцевого кристаллического датчика, покрытый диоксидом кремния, воздействию кислородной плазмы в течение 30 секунд при максимальной радиочастотной мощности в кислородной плазменной камере. Извлеките микросхему из камеры и немедленно установите микросхему в измерительную камеру, здесь перед экспериментом используются четырехканальные микровесы из кварцевых кристаллов.

Приобретите частоту и рассеивание цензуры и воздуха, чтобы обеспечить надлежащий монтаж. Для этого запустите программу qof. Нажмите «Захват» и выберите «Настройка измерения» в новом окне, которое появится, отметьте обертоны 3, 5, 7, 9, 11 и 13.

Затем нажмите «Найти и выполнить». Для того чтобы проверить резонансные спектры, установите температуру на уровне 24 градусов по Цельсию. После того, как будет выполнен правильный монтаж, запустите перистальтический насос и буферный раствор в измерительной камере со скоростью расхода 100 микролитров в минуту в программном обеспечении, нажмите кнопку «Захват» и выберите «Повторный запуск измерения», чтобы записать резонансную частоту и сигналы рассеивания энергии.

Повторяйте этот шаг до тех пор, пока не будет получен стабильный базовый уровень. Для сдвигов частоты и диссипации. Вводите изопропанол без липидов в течение 10 минут.

Затем следует инъекция липидно-холестериновой смеси DOPC в нужном молярном соотношении с общей концентрацией лип 0,5 мг на миллилитр в изопропанол в течение 10 минут. Далее впрыскиваем буфер в течение 20 минут со скоростью потока 100 микролитров в минуту. Затем вводят раствор одного миллимолярного метилбета-циклодекстрина, приготовленного в буфере, до тех пор, пока частотный сигнал не достигнет стабильного значения.

Измерьте относительные положительные сдвиги частоты, вызванные стадией лечения метил-бета-циклодекстрином, и рассчитайте массивный холестерин и липиды DOPC, как описано в текстовом протоколе. Затем рассчитайте молярную долю холестерина в поддерживаемом липидном бислое, учитывая молекулярные массы липидов и холестерина ДОПК. Здесь представлено репрезентативное изображение липидного бислоя A-D-O-P-C, содержащего 0,5 весового процента меченого DOPE липида рубина, сформированного на стеклянных поверхностях методом SAL.

Флуоресцентное восстановление после эксперимента с фотообесцвечиванием показало почти полное восстановление флуоресценции, что указывает на латеральную текучесть липидного бислоя. Здесь представлены репрезентативные кривые QCMD сдвигов частоты и диссипации для формирования поддерживаемых бислоев. С помощью метода SAL показаны конечные резонансные сдвиги частоты и достигнуты сдвиги диссипации, которые соответствуют формированию планера бислоя после освоения.

Эту технику можно выполнить за 30 минут, если она выполнена правильно. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее представление о том, как изготавливать поддерживаемые биомембраны с использованием метода липидного бислоя с помощью растворителя При выполнении этой процедуры важно не забывать готовить свежие липидные растворы перед экспериментом и оптимизировать обмен растворителя фтора в зависимости от вашей экспериментальной установки после этой процедуры. другие методы, такие как атомно-силовая микроскопия, могут быть выполнены для того, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как формирование мембранных доменов.