Скринируемый В Vivo Анализ митохондриальных Модуляторы с использованием трансгенных БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЕ Caenorhabditis Элеганс

Общая цель данного эксперимента заключается в выявлении митохондриальной токсичности или полезных эффектов лекарственных препаратов с использованием модельного организма. C элегантность. Это достигается путем количественного определения in vivo уровней TP в трансгенных штаммах морского элгана, которые экспрессируют фермент крестоцветный светлячок, слитый с зеленым флуоресцентным белком.

Ген слияния наделяет нематод двумя различными свойствами. Первая заключается в том, что при появлении субстрата Люцифера нематоды излучают свет в видимом диапазоне пропорционально их клеточным запасам A TP. А второе заключается в том, что при освещении соответствующей длиной волны они будут проявлять сильную зеленую флуоресценцию.

Флуоресценция не зависит от уровня TP у нематод и пропорциональна их массе или численности. Таким образом, его можно использовать для нормализации измерений биолюминесценции. Во время типичного анализа популяция червей, синхронизированных в развитии, выращивается до личиночной стадии L 4.

Затем нематоды обрабатывают исследуемыми лекарственными соединениями в течение определенного периода времени до измерения как флуоресценции, так и биолюминесценции. Результаты показывают потенциальную токсичность препарата. Когда биолюминесценция снижается, усиленный сигнал указывает на попадание в дальнейший тест на благотворное влияние на функцию митохондрий.

Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как скрининг лекарств на культивируемых клетках, заключается в том, что скрининг проводится в физиологическом контексте всего живого многоклеточного организма с почти 50% генетической офтальмологией для человека. И, как и у людей, элегантность на самом деле требует окислительного фосфорилирования митохондрий, чтобы развиться во взрослом возрасте, и ее митохондрии также имеют много общих характеристик с митохондриями млекопитающих с точки зрения их структуры, их функции, их биоэнергетики. К препарату представляет интерес и засеивание аналогичного количества нематод в каждую из скважин, ну и конечно же, избежание заражения в первый день. В стерильных условиях переложите нематод с одной шестисантиметровой нематоды питательной среды в двух миллилитрах S полной среды в колбу с 30 граммами на литр кишечной палочки.

ОП 50 в полной среде, затем инкубировать колбу с встряхиванием на четвертый день, отбелить культуру нематод GR для сбора яиц и синхронизации популяции червей. Затем инкубируйте яйца в течение ночи в стеклянной колбе, содержащей 15 миллилитров S полной среды, с встряхиванием на следующий день, на пятый день, нематоды будут находиться на той же стадии роста. Чтобы определить количество вылупившихся червей с помощью чистого наконечника, каждый раз перекладывайте три 100 микролитров аликвот нематод в отдельные микропробирки, содержащие 900 микролитров среды, с добавлением 0,01% твин 20 пипетируя вверх и вниз несколько раз, чтобы выпустить любых червей, прилипших к кончику.

Затем подсчитайте нематоды в четырех отдельных каплях по 10 мкл из каждой из тройных пробирок для разведения, и вычислите объем суспензии нематоды, необходимый для установки двух культур по 20 мл с 10 нематодами на 10 мкл, сцедите примерные объемы в две предварительно взвешенные 15 мл конические пробирки. Взвесьте пробирки, чтобы определить фактический объем дозирования. Затем необходимо аккуратно отрегулировать целевые объемы вихря и убрать лишние объемы.

Теперь промойте нематод в общей сложности 14 миллилитров свежего S, полную среду на тюбик и суспензируйте гранулы в пяти миллилитрах полной среды S с 30 граммами на литр рава. ПОСТАНОВЛЯЮЩАЯ ЧАСТЬ 50. Переложите нематод в конические стеклянные колбы, содержащие 15 миллилитров S в комплекте с 30 граммами на литр рави.

ОП 50 в общем объеме 20 миллилитров на колбу и записывают время кормления. Усредните количество нематод в девяти каплях по 10 микролитров, чтобы подтвердить, что культуры разбавлены до 10 нематод на 10 микролитров. Поместите культуры в инкубатор на срок от 42 до 44 часов.

На седьмой день вытащите культуры нематод в одну колбу с непрерывным легким вращением. Затем переложите три, четыре миллилитровые аликвоты нематод в одну стерильную кормушку объемом 60 миллилитров. Используйте восьмиканальную пипетку для Eloqua, 25 микролитров взвешенных нематод на лунку на 96.

Хорошо получаются черные микротитровые пластины с плоским, прозрачным дном. Затем верните крышки на тарелки и отложите тарелки в сторону. Каждый раз, когда будут засеяны две пластины, перекладывайте в кормушку еще две, 2,5 миллилитровые аликвоты нематод, чтобы восполнить потерянный объем.

После посева от 13 до 14 пластин нематодами добавьте в каждую лунку по 74 мкл полной среды S и перенесите пластины во влажную камеру и встряхивающий инкубатор до введения препарата, пока пластины встряхивают. Разморозьте 2 96 сварных пластин для испытаний. Затем с помощью многоканальной пипетки и каждый раз меняя наконечники.

Переложите один микролитр из первой колонки первой пластины с лекарством в колонки с первой по пятую пластины с нематодой. Переложите еще один микролитр из второго столбца лекарственной пластины в столбцы с восьмого по 12-й нематоды. Затем добавьте по одному микролитру транспортного средства в шестой и седьмой столбцы пластины с нематодой.

Используйте оставшиеся столбцы на пластине с лекарством для обработки остальных пластин от нематоды таким же образом, не забыв включить две пластины, обработанные всем транспортным средством. Затем верните все планшеты во влажные камеры в встряхивающем инкубаторе еще на 20-22 часа на восьмой день. Чтобы подготовить контрольную пластину фона для показаний флуоресценции, объедините содержимое лунки из пластины, обработанной нематодами на транспортном средстве, и дайте нематодам осесть в течение двух-трех минут.

Затем соберите бактерии, содержащие snat и загрузите по 100 микролитровых образцов в каждую лунку черного микропланшета с прозрачным дном. Рассмотрите пластину под микроскопом, отмечая лунки, в которых можно увидеть нематоды, чтобы исключить эти лунки из оценки флуоресцентного фона. Затем считайте флуоресценцию, чтобы измерить биолюминесценцию для каждой пластины.

В свою очередь, выдайте каждому по 50 микролитров свежеприготовленного люминесцентного буфера, хорошо поместите тарелку на трясущуюся платформу и запустите таймер через три минуты. Считывание люминесценции через одну секунду за измерение. В этом первом репрезентативном эксперименте гниль, известный как ингибитор митохондриального комплекса, снижал световой поток нематод как после относительно короткого, так и более длительного воздействия в диапазоне концентраций.

В данном эксперименте было показано, что гербицид паракват достоверно снижает биолюминесценцию флуоресценции GFP и нормализует биолюминесценцию штамма С PE 2 54. Кроме того, снижение биолюминесценции было больше, чем у флуоресценции, что согласуется с известными эффектами снижения митохондриальной функции и снижения продукции TP, вызванной препаратом. На этом графике показан пример соединения, усиливающего биолюминесценцию нематоды, промежуточного продукта цикла лимонной кислоты оксалоацетата при однократной концентрации восемь миллимоляров.

Обратите внимание, что экспериментальная вариабельность, наблюдаемая между этими повторными прогонами, не является чем-то необычным для экспериментов, основанных на «Люцифере». Здесь было обнаружено, что ингибирующие люциферазу светлячков влияют на активность люцифер in vitro на 25 микромолях и 100 микромолях с почти полным ослаблением активности соединением DDD. 1, 4 3 4, хотя это и не сопоставимо с прямыми сравнениями, значительное снижение биолюминесценции наблюдалось и после лечения ингибиторным соединением Люцифера in vivo.

Демонстрация того, что изменения биолюминесценции могут быть результатом действия ингибиторов фермента Люцифера, а не изменений в уровнях А ТП in vivo. При проведении этой процедуры важно учитывать, что соединения могут влиять на активность фермента люциферазы светлячка напрямую, а не влиять на энергетический статус червя. Таким образом, субтепло можно проверить с помощью многих методов оценки митохондриальной функции, таких как, например, определение потребления кислорода, определение потенциала активных форм кислорода в митохондриальной мембране или визуализация митохондрий в штаммах морской элегантности.

С меткой GFP, митохондрии.