ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Авторы хотели бы поблагодарить Дэвида Грея из подразделения Dundee Drug Discovery за люциферазу за люциферазу светлячковых DDD00001434, DDD0001477, DDD00000635 и DDD00023047; Тибор Харкани (Медицинский университет Вены) за предложение оксалоацетата в качестве исследуемого соединения; и Чарли Дир (Университет Абердина) за иллюстрации. Эта работа была профинансирована премией BBSRC Pathfinder award (BB/FOF/PF/4/11) и Университетом Абердина.

<ol><li>Lagido, C., Pettitt, J., Flett, A., Glover, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bridging+the+phenotypic+gap%3A+real-time+assessment+of+mitochondrial+function+and+metabolism+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Physiol%22%5BJournal%5D)">Bridging the phenotypic gap: real-time assessment of mitochondrial function and metabolism of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> BMC Physiol. 8, 7(2008).</li>
<li>Lagido, C., McLaggan, D., Flett, A., Pettitt, J., Glover, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+sublethal+toxicity+assessment+using+bioluminescent+Caenorhabditis+elegans%2C+a+novel+whole-animal+metabolic+biosensor%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Rapid sublethal toxicity assessment using bioluminescent Caenorhabditis elegans, a novel whole-animal metabolic biosensor.</a> Toxicol Sci. 109, 88-95 (2009).</li>
<li>McLaggan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+sublethal+levels+of+environmental+pollutants+found+in+sewage+sludge+on+a+novel+Caenorhabditis+elegans+model+biosensor%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Impact of sublethal levels of environmental pollutants found in sewage sludge on a novel Caenorhabditis elegans model biosensor.</a> PloS one. 7, e46503(2012).</li>
<li>Rodriguez-Enriquez, S., Juarez, O., Rodriguez-Zavala, J. S., Moreno-Sanchez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multisite+control+of+the+Crabtree+effect+in+ascites+hepatoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Multisite control of the Crabtree effect in ascites hepatoma cells.</a> Eur J Biochem. 268, 2512-2519 (2001).</li>
<li>Marroquin, L. D., Hynes, J., Dykens, J. A., Jamieson, J. D., Will, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circumventing+the+Crabtree+effect%3A+replacing+media+glucose+with+galactose+increases+susceptibility+of+HepG2+cells+to+mitochondrial+toxicants%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Circumventing the Crabtree effect: replacing media glucose with galactose increases susceptibility of HepG2 cells to mitochondrial toxicants.</a> Toxicol Sci. 97, 539-547 (2007).</li>
<li>Rooney, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+5%27-fluoro-2-deoxyuridine+on+mitochondrial+biology+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Effects of 5'-fluoro-2-deoxyuridine on mitochondrial biology in Caenorhabditis elegans.</a> Exp Gerontol. 56, 69-76 (2014).</li>
<li>Bodhicharla, R., Ryde, I. T., Prasad, G. L., Meyer, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tobacco-specific+nitrosamine+4-%28methylnitrosamino%29-1-%283-pyridyl%29-1-butanone+%28NNK%29+induces+mitochondrial+and+nuclear+DNA+damage+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Mol+Mutagen%22%5BJournal%5D)">The tobacco-specific nitrosamine 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NNK) induces mitochondrial and nuclear DNA damage in Caenorhabditis elegans.</a> Environ Mol Mutagen. 55, 43-50 (2014).</li>
<li>Leung, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+early+life+exposure+to+ultraviolet+C+radiation+on+mitochondrial+DNA+content%2C+transcription%2C+ATP+production%2C+and+oxygen+consumption+in+developing+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Pharmacol+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Effects of early life exposure to ultraviolet C radiation on mitochondrial DNA content, transcription, ATP production, and oxygen consumption in developing Caenorhabditis elegans.</a> BMC Pharmacol Toxicol. 14, 9(2013).</li>
<li>Kuang, J. J., Ebert, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+failure+to+extend+lifespan+via+disruption+of+complex+II+is+linked+to+preservation+of+dynamic+control+of+energy+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">The failure to extend lifespan via disruption of complex II is linked to preservation of dynamic control of energy metabolism.</a> Mitochondrion. 12, 280-287 (2012).</li>
<li>Lagido, C., Pettitt, J., Porter, A. J., Paton, G. I., Glover, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+application+of+bioluminescent+Caenorhabditis+elegans+as+multicellular+eukaryotic+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Development and application of bioluminescent Caenorhabditis elegans as multicellular eukaryotic biosensors.</a> FEBS Lett. 493, 36-39 (2001).</li>
<li>Lewis, J. A., Fleming, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+culture+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Basic culture methods.</a> Methods Cell Biol. 48, 3-29 (1995).</li>
<li>Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStiernagle%2C+T+%22WormBook%22">WormBook</a>. , 1-11 (2006).</li>
<li>Brenk, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lessons+learnt+from+assembling+screening+libraries+for+drug+discovery+for+neglected+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22ChemMedChem%22%5BJournal%5D)">Lessons learnt from assembling screening libraries for drug discovery for neglected diseases.</a> ChemMedChem. 3, 435-444 (2008).</li>
<li>Lagido, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLagido%2C+C+%22Nematodes+as+environmental+indicators%22">Nematodes as environmental indicators</a>. Wilson, M. J., Kakouli-Duarte, T. , CABI. 225-251 (2009).</li>
<li>Thorne, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Firefly+luciferase+in+chemical+biology%3A+a+compendium+of+inhibitors%2C+mechanistic+evaluation+of+chemotypes%2C+and+suggested+use+as+a+reporter%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Firefly luciferase in chemical biology: a compendium of inhibitors, mechanistic evaluation of chemotypes, and suggested use as a reporter.</a> Chem Biol. 19, 1060-1072 (2012).</li>
<li>Houtkooper, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitonuclear+protein+imbalance+as+a+conserved+longevity+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mitonuclear protein imbalance as a conserved longevity mechanism.</a> Nature. 497, 451-457 (2013).</li>
<li>Andreux, P. A., Houtkooper, R. H., Auwerx, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+approaches+to+restore+mitochondrial+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Pharmacological approaches to restore mitochondrial function.</a> Nat Rev Drug Discov. 12, 465-483 (2013).</li>
<li>Tsang, W. Y., Lemire, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+genome+content+is+regulated+during+nematode+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Bioph+Res+Co%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial genome content is regulated during nematode development.</a> Biochem Bioph Res Co. 291, 8-16 (2002).</li>
<li>Decuyper, C., Vanfleteren, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen-Consumption+during+Development+and+Aging+of+the+Nematode+Caenorhabditis-Elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Biochem+Phys+A%22%5BJournal%5D)">Oxygen-Consumption during Development and Aging of the Nematode Caenorhabditis-Elegans.</a> Comp Biochem Phys A. 73, 283-289 (1982).</li>
<li>Dillin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rates+of+behavior+and+aging+specified+by+mitochondrial+function+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rates of behavior and aging specified by mitochondrial function during development.</a> Science. 298, 2398-2401 (2002).</li>
<li>Zheng, S. Q., Ding, A. J., Li, G. P., Wu, G. S., Luo, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+absorption+efficiency+in+Caenorhbditis+elegans+delivered+by+different+methods%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Drug absorption efficiency in Caenorhbditis elegans delivered by different methods.</a> PloS one. 8, e56877(2013).</li>
<li>Yochem, J., Gu, T., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+marker+for+mosaic+analysis+in+Caenorhabditis+elegans+indicates+a+fusion+between+hyp6+and+hyp7%2C+two+major+components+of+the+hypodermis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A new marker for mosaic analysis in Caenorhabditis elegans indicates a fusion between hyp6 and hyp7, two major components of the hypodermis.</a> Genetics. 149, 1323-1334 (1998).</li>
<li>Vanfleteren, J. R., DeVreese, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rate+of+aerobic+metabolism+and+superoxide+production+rate+potential+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Zool%22%5BJournal%5D)">Rate of aerobic metabolism and superoxide production rate potential in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> J Exp Zool. 274, 93-100 (1996).</li>
<li>Garigan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+tissue+aging+in+Caenorhabditis+elegans%3A+a+role+for+heat-shock+factor+and+bacterial+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of tissue aging in Caenorhabditis elegans: a role for heat-shock factor and bacterial proliferation.</a> Genetics. 161, 1101-1112 (2002).</li>
<li>Davies, S. K., Leroi, A. M., Bundy, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorodeoxyuridine+affects+the+identification+of+metabolic+responses+to+daf-2+status+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Fluorodeoxyuridine affects the identification of metabolic responses to daf-2 status in Caenorhabditis elegans.</a> Mech Ageing Dev. 133, 46-49 (2012).</li>
<li>Partridge, F. A., Tearle, A. W., Gravato-Nobre, M. J., Schafer, W. R., Hodgkin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C.+elegans+glycosyltransferase+BUS-8+has+two+distinct+and+essential+roles+in+epidermal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The C. elegans glycosyltransferase BUS-8 has two distinct and essential roles in epidermal morphogenesis.</a> Dev Biol. 317, 549-559 (2008).</li>
<li>Castro, P. V., Khare, S., Young, B. D., Clarke, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+Battling+Starvation+Stress%3A+Low+Levels+of+Ethanol+Prolong+Lifespan+in+L1+Larvae%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans Battling Starvation Stress: Low Levels of Ethanol Prolong Lifespan in L1 Larvae.</a> PloS one. 7, (2012).</li>
<li>Baugh, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+Grow+or+Not+to+Grow%3A+Nutritional+Control+of+Development+During+Caenorhabditis+elegans+L1+Arrest%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">To Grow or Not to Grow: Nutritional Control of Development During Caenorhabditis elegans L1 Arrest.</a> Genetics. 194, 539-555 (2013).</li>
<li>Baugh, L. R., DeModena, J., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Pol+II+Accumulates+at+Promoters+of+Growth+Genes+During+Developmental+Arrest%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA Pol II Accumulates at Promoters of Growth Genes During Developmental Arrest.</a> Science. 324, 92-94 (2009).</li>
<li>Maxwell, C. S., Antoshechkin, I., Kurhanewicz, N., Belsky, J. A., Baugh, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+control+of+mRNA+isoform+expression+during+developmental+arrest+and+recovery+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Nutritional control of mRNA isoform expression during developmental arrest and recovery in C. elegans.</a> Genome Res. 22, 1920-1929 (2012).</li>
<li>Cressman, C. P., Williams, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reference+toxicants+for+toxicity+testing+using+Caenorhabditis+elegans+in+aquatic+media%5BTitle%5D)+AND+%22Am+Soc+Test+Mater%22%5BJournal%5D)">Reference toxicants for toxicity testing using Caenorhabditis elegans in aquatic media.</a> Am Soc Test Mater. 131, 518-532 (1997).</li>
<li>Khanna, N., Cressman, C. P., Tatara, C. P., Williams, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tolerance+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans+to+pH%2C+salinity%2C+and+hardness+in+aquatic+media%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Environ+Con+Tox%22%5BJournal%5D)">Tolerance of the nematode Caenorhabditis elegans to pH, salinity, and hardness in aquatic media.</a> Arch Environ Con Tox. 32, 110-114 (1997).</li>
<li>Benedetti, C., Haynes, C. M., Yang, Y., Harding, H. P., Ron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin-like+protein+5+positively+regulates+chaperone+gene+expression+in+the+mitochondrial+unfolded+protein+response%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin-like protein 5 positively regulates chaperone gene expression in the mitochondrial unfolded protein response.</a> Genetics. 174, 229-239 (2006).</li>
<li>Yang, W., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mitochondrial+Superoxide+Signal+Triggers+Increased+Longevity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+Biol%22%5BJournal%5D)">A Mitochondrial Superoxide Signal Triggers Increased Longevity in Caenorhabditis elegans.</a> Plos Biol. 8, (2010).</li>
</ol>

Авторы не имеют ничего раскрывать

Общая цель этой процедуры является быстрое количественное определение энергетического состояния С. Элеганс в естественных условиях с целью использования этого в качестве конечной точки в соединении скрининга. Обоснованием основан на трансгенной экспрессии гена люциферазы светлячка в нематоды C. Элеганс 1-3 с помощью плазмиды pSLGCV (1 <a href="https://www.addgene.org/49862" target="_blank">https://www.addgene.org/49862~~HEAD=pobj).</a> Люциферазы фермент, слитый с зеленым флуоресцентным белком GFP и выражается конститутивно и повсеместно в цитоплазме (The люциферазы пероксисом ориентации сигнал был удален). Это приводит к эмиссии света, когда подложка люциферин обеспечивается экзогенно. Как червь является прозрачным, свет может быть измерена с помощью люминометра в виде относительных световых единиц (RLU). Сотовые ATP топлива реакция биолюминесценции и ее доступность определяет уровень освещенности, произведенные. Следовательно, luminometry предлагает convenienт средства оценки уровней относительных АТФ и расширение функции митохондрий, так как производство АТФ происходит главным образом в митохондриях. Связь между митохондриальных функциональных уровней и биолюминесценции было продемонстрировано ранее через глушителей митохондриальных генов цепи переноса электронов и сопутствующей снижению светоотдачи. 1 Штаммы биолюминесценции, полученные были обозначены PE254 (feIs4) и PE255 (feIs5) 1 (список материалов) и может быть использован как взаимозаменяемые. 3 Ряд исследований использовали эти штаммы датчика сообщить о сотовых АТФ уровней в естественных условиях после воздействия различных ксенобиотиков химических веществ, таких, как азид натрия 1, кадмия 2, канализации Экстракт осадка 3, 5&#39;-фтор-2-дезоксиуридин 6 и табак-специфичных нитрозаминов 7. Штаммы были также полезны для мониторинга последствий воздействия ультрафиолетового излучения C <sдо&gt; 8 и эффекты нарушая функции митохондрий дыхательной цепи. 1,9 Ранняя версия датчика люминесценции, выражающей ген люциферазы без GFP слияния (PE39) также были использованы в исследовании воздействия тяжелых металлов и респираторных . разобщающий 10 Штаммы PE254 и PE255 нести люциферазы: GFP слияние и GFP флуоресценции показано, что увеличение пропорционально нематод массы, предлагая удобные средства для нормализации значений люминесценции 6,9 Последствия дифференциального количества червей на лунку может быть. учтены в том числе несколько технических повторов в анализе (минимум 5 скважин в состоянии). 3 Протокол предоставляет возможность мониторинга в естественных условиях энергетических уровней (в отличие от более технически трудоемким в пробирке определения АТФ), что позволяет соединение скрининг и изменение в физиологическом контексте целого муlticellular организм. Эта процедура может быть расширена до различных генетических фоны, пересекая хромосомно интегрированный трансген в доступных мутантных штаммов и / или по глушителей генов от РНК-интерференции; Таким образом, в полной мере воспользоваться С. Элеганс в качестве модельного организма. Метод должен помочь уменьшить поздней стадии недостаточности наркотиков кандидатов в связи с митохондриальной токсичности и внести свой вклад в сокращение высшего испытаний на животных.

<table><tbody><tr><td>Микропланшетный люминометр Orion II</td><td>Berthold Detection Systems</td><td></td><td>с инжектором и программным обеспечением Simplicity 4.2; передача данных в Excel по окончании измерения пластины</td></tr><tr><td>флуориметром FLx800;</td><td>Biotek</td><td></td><td>с программным обеспечением Gen5; передача данных в Excel в конце измерения планшета</td></tr><tr><td>Ks 130 базовая платформа для встряхивания</td><td>Ika</td><td>#0002980000</td><td></td></tr><tr><td>Innova 4349</td><td>Нью-Брансуик Научный</td><td></td><td>охлаждаемый инкубатор шейкер</td></tr><tr><td>Eppendorf центрифуга 5804R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>с ротором eppendorf A-4-44&nbsp; (для 50/15&#160; мл тубы)</td></tr><tr><td>Стрипэтка, Costar</td><td>Corning</td><td>#4489</td><td>Серологическая пипетка</td></tr><tr><td>Cellstar 50 мл тубы</td><td>Greiner bio-one</td><td>#227661</td><td></td></tr><tr><td>Cellstar 15 мл тубы</td><td>Greiner bio-one</td><td>#188261</td><td></td></tr><tr><td>Cellstar 60 мм тканевые культуральные планшеты&nbsp;</td><td>Greiner bio-one</td><td>#628160</td><td></td></tr><tr><td>Предметные стекла для микроскопа Superfrost</td><td>VWR</td><td>#631-0909</td><td></td></tr><tr><td>Стерильный шпатель</td><td>Corning</td><td>#3007; #3004</td><td>для взвешивания химикатов</td></tr><tr><td>0,22 мМ Millex GP фильтры</td><td>Millipore</td><td>#SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Axygen eppendorf tubes 1,5 мл</td><td>Fisher Scientific</td><td>#MCT-150-R</td><td></td></tr><tr><td>Corning 96 пластина для анализа</td><td>VWR</td><td>#3603</td><td>Черная пластина с прозрачным дном и крышкой</td></tr><tr><td>Nunc 96 Пластина для анализа лунок</td><td>Fisher Scientific</td><td>#236105</td><td>Белая пластина с крышкой</td></tr><tr><td>Реактив для резервуара 60 мл</td><td>Thermo Scientific Finnpipette</td><td>#9510027</td><td>используется в качестве кормушки для нематод в разделе протокола 4.4.1</td></tr><tr><td>Коробка для хранения/влажная камера</td><td>Roche Diagnostics</td><td>#10 800 058 001</td><td>174 х 101 х 56,6 мм, используется как влажная камера с влажными бумажными полотенцами; 2x 96-луночные планшеты с крышками могут поместиться в одну, нижнюю сидящую сверху крышку микропланшета</td></tr><tr><td>Отбеливатель: Раствор гипохлорита натрия 4-4,99% Содержание хлора</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#239305</td><td>Хранить в аликвотах при 4&#160; &deg; С,&nbsp; запечатать парапленкой для предотвращения потери хлора и покрыть фольгой</td></tr><tr><td>D-люциферин, калийную соль</td><td>Biotium Inc</td> <td># 10101-2</td><td>Молекулярные зонды также могут быть использованы в качестве поставщика; приготовьте запас 20 мМ в ddH2O, держите при -20 °°; C in aliquots</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td># P9416</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>CalBiochem</td><td>#317275</td><td>Purity 99.99%Triton</td></tr> <tr><td>X100</td><td>Alfa Aesar</td><td>#A16046</td><td>Diltute до 10% в ddH2O</td></tr><tr><td>Nystatin</td><td>CalBiochem</td><td>#475914</td><td></td></tr><tr><td>C. elegans биолюминесцентные штаммы</td><td>Собственная лаборатория автора</td><td>PE254, PE255</td><td>содержат интегрированные матрицы feIs4 и feIs5 [Psur-5::luc+::gfp; rol-6(su1006)] соответственно на хромосоме V и X; отбирать для однородной и сильной экспрессии luc::GFP методом флуоресцентной микроскопии (e. выбрать 15 червей) время от времени.</td></tr><tr><td>E. coli OP50</td><td>CGC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>General Chemicals</td><td>Sigma Aldrich/Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

Скринируемый<em&gt; В vivo</em&gt; Анализ митохондриальных Модуляторы с использованием трансгенных БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЕ<em&gt; caenorhabditis Элеганс</em

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

Многоклеточный модельный организм Caenorhabditis elegans - это маленькая нематода размером примерно 1 мм во взрослом возрасте, которая генетически и экспериментально поддается лечению. Он экономичен и прост в культивировании и дозировании в жидкой среде, что делает его хорошо подходящим для грохочения со средней пропускной способностью. Ранее мы валидировали использование трансгенной люциферазы, экспрессирующей штаммы C. elegans, для быстрой оценки in vivo уровней АТФ у нематоды. 1-3 Здесь мы представляем необходимые материалы и методику для проведения биотестов с биолюминесцентными штаммами C. elegans PE254 или PE255 (или любыми их производными штаммами). Протокол позволяет in vivo обнаруживать сублетальные эффекты препаратов, которые могут идентифицировать митохондриальную токсичность, а также обнаруживать in vivo потенциальные полезные эффекты лекарств. Представлены репрезентативные результаты для химических веществ параквата, ротенона, оксалоацетата и четырех ингибиторных соединений люциферазы светлячков. Методология может быть масштабирована, чтобы обеспечить платформу для скрининга библиотек лекарств на наличие соединений, способных модулировать функцию митохондрий. Доклиническая оценка токсичности лекарственного препарата часто проводится на иммортализированных раковых клеточных линиях человека, которые получают АТФ в основном из гликолиза и часто толерантны к митохондриальным токсикантам. 4,5 Напротив, C. elegans зависит от окислительного фосфорилирования для поддержания развития во взрослом возрасте, проводя параллель с человеком и предоставляя уникальную возможность для оценки соединений в физиологическом контексте всего живого многоклеточного организма.

Описан протокол для обнаружения in vivo эффектов митохондриальных ингибиторов в модельном организме Caenorhabditis elegans и для идентификации потенциально усиливающих соединений. Этот протокол может быть использован для скрининга библиотек лекарств на наличие соединений, модулирующих функцию митохондрий.

Скринируемый<em&gt; В Vivo</em&gt; Анализ митохондриальных Модуляторы с использованием трансгенных БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЕ<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and ...

Общая цель следующего эксперимента заключается в выявлении митохондриальной токсичности или полезного действия препаратов с использованием модельного организма C. elegance. Это достигается путем количественного определения уровней ATP in vivo в трансгенных штаммах морской нематоды, экспрессирующих люциферазу светлячка, слитую с зеленым флуоресцентным белком.Слитый ген придает нематодам два различных свойства. Первое заключается в том, что при добавлении субстрата люциферина нематоды излучают свет в видимом диапазоне пропорционально их клеточным запасам ATP. Второе — при освещении волной соответствующей длины они проявляют сильную зеленую флуоресценцию.Флуоресценция не зависит от уровней TP в нематодах и пропорциональна их массе или количеству. Следовательно, её можно использовать для нормализации показателей биолюминесценции. В ходе типичного анализа популяцию developmentally synchronized червей выращивают до стадии личинки L4.Затем нематоды обрабатываются исследуемыми лекарственными соединениями в течение определенного периода времени перед измерением как флуоресценции, так и биолюминесценции. Результаты демонстрируют потенциальную токсичность препарата. При снижении биолюминесценции усиление сигнала указывает на перспективное соединение («хит») для дальнейшего тестирования на наличие благотворного влияния на функцию митохондрий.Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими способами, такими как скрининг препаратов на культурах клеток, является то, что скрининг проводится в физиологическом контексте целого живого многоклеточного организма, имеющего почти 50% генетического сходства в области офтальмологии с человеком. Как и человеку, элегансу для развития до взрослого состояния требуется митохондриальное окислительное фосфорилирование, а его митохондрии разделяют с митохондриями млекопитающих многие характеристики с точки зрения структуры, функции и биоэнергетики. Критическими параметрами протокола являются стадия развития, на которой начинается воздействие, продолжительность воздействия препарата на нематоду, посев одинакового количества нематод в каждую из лунок и, разумеется, предотвращение контаминации. В первый день в стерильных условиях перенесите нематод с одной чашки с питательной средой для роста нематод диаметром 6 см, содержащей 2 мл полной среды S, в колбу с E. coli в концентрации 30 г/л.OP 50 в полной среде S, затем инкубируйте колбу с встряхиванием. На четвертый день обработайте культуру нематод GR отбеливателем для сбора яиц и синхронизации популяции червей. Затем инкубируйте яйца в течение ночи в стеклянной колбе, содержащей 15 milliliters полной среды S, при встряхивании. На следующий день, пятый день, нематоды будут находиться на одной стадии роста. Чтобы определить количество вылупившихся червей, перенося по три аликвоты нематод объемом 100 µL в отдельные микропробирки, содержащие 900 µL среды с добавлением 0.01% tween 20, используя каждый раз чистый наконечник и несколько раз пипетируя содержимое вверх-вниз, чтобы освободить червей, прилипших к наконечнику.Затем подсчитайте количество нематод в четырех отдельных каплях по 10 µL из каждой из трех пробирок с разведениями и рассчитайте объем суспензии нематод, необходимый для создания двух культур по 20 mL с концентрацией 10 нематод на 10 µL; перелейте приблизительные объемы в две предварительно взвешенные конические пробирки объемом 15 mL. Взвесьте пробирки, чтобы определить фактически отмеренный объем. Затем, для корректировки целевых объемов, осторожно перемешайте содержимое на вортексе и удалите избыточный объем.Теперь промойте нематод в общем объеме 14 миллилитров свежей полной среды S на пробирку и ресуспендируйте осадок в пяти миллилитрах полной среды S с добавлением 30 грамм на литр OP 50. Перенесите нематод в конические стеклянные колбы, содержащие 15 миллилитров полной среды S с 30 граммами на литр OP 50.до общего объема 20 мл на колбу и зафиксируйте время кормления. Вычислите среднее количество нематод в девяти каплях по 10 мкл, чтобы подтвердить, что культуры разведены до концентрации 10 нематод на 10 мкл. Поместите культуры в инкубатор на 42–44 часа.На седьмой день соберите культуры нематод в одну колбу при непрерывном осторожном перемешивании. Затем перенесите аликвоты нематод объемом по 3–4 мл в один стерильный кювет объемом 60 мл. С помощью восьмиканального дозатора внесите по 25 µL суспензии нематод в каждую лунку 96-луночного планшета.Используйте черные микротитрационные планшеты с плоским прозрачным дном. Затем закройте планшеты крышками и отставьте их в сторону. Каждый раз после посева двух планшетов переносите в кювету еще две аликвоты нематод объемом 2,5 milliliter, чтобы восполнить потерю объема.После посева нематод на 13–14 планшетов добавьте по 74 µL полной среды S в каждую лунку, затем перенесите планшеты во влажную камеру и в шейкер-инкубатор до момента введения препарата, обеспечивая постоянное перемешивание планшетов. Разморозьте 2 96-луночных планшета с препаратами для тестирования. Далее используйте многоканальный дозатор, меняя наконечники при каждой операции.Перенесите 1 µL из первого столбца первого планшета с препаратами в столбцы с первого по пятый планшета с нематодами. Перенесите еще 1 µL из второго столбца планшета с препаратами в столбцы с восьмого по двенадцатый планшета с нематодами. Затем добавьте 1 µL растворителя в шестой и седьмой столбцы планшета с нематодами.Используйте оставшиеся колонки планшета с препаратами, чтобы таким же образом обработать остальные планшеты с нематодами, обязательно включив две планшеты, обработанные только растворителем. Затем верните все планшеты во влажные камеры в шейкер-инкубатор еще на 20–22 часа на восьмой день. Чтобы подготовить контрольный планшет для измерения фоновой флуоресценции, объедините содержимое лунок из планшета с нематодами, обработанными только растворителем, и дайте нематодам осесть в течение двух-трех минут.Затем соберите бактерии, содержащие snat, и внесите образцы объемом 100 microliter в каждую лунку черного микропланшета с прозрачным дном. Осмотрите планшет под микроскопом и отметьте лунки, в которых видны нематоды, чтобы исключить эти лунки из расчета фоновой флуоресценции. После этого измерьте флуоресценцию для определения биолюминесценции в каждом планшете.Затем в каждую лунку внесите по 50 µL свежеприготовленного люминесцентного буфера, поместите планшет на шейкер и запустите таймер на три минуты. Измерьте люминесценцию с интервалом в одну секунду на одно измерение. В данном первом репрезентативном эксперименте ротенон, известный ингибитор митохондриального комплекса I, снизил интенсивность свечения нематод как при относительно коротком, так и при длительном воздействии в диапазоне различных концентраций.В данном эксперименте было продемонстрировано, что гербицид паракват значительно снижает флуоресценцию GFP и нормированную биолюминесценцию штамма C PE 2 54. Кроме того, снижение биолюминесценции было более выраженным, чем снижение флуоресценции, что согласуется с известными эффектами препарата, заключающимися в ухудшении функции митохондрий и снижении выработки ATP. На этом графике представлен пример соединения, усиливающего биолюминесценцию нематод — промежуточного продукта цикла лимонной кислоты оксалоацетата в единичной концентрации 8 мМ.Следует отметить, что экспериментальная вариабельность, наблюдаемая между этими повторными запусками, не является необычной для экспериментов на основе люциферазы. В данном случае было замечено, что соединения-ингибиторы люциферазы светляка влияют на активность люциферазы in vitro при концентрациях 25 micromolar и 100 micromolar, при этом соединение DDD привело к почти полному подавлению активности. 1, 4 3 4, хотя результаты и не являются напрямую сопоставимыми, значительное снижение биолюминесценции наблюдалось также после обработки ингибиторами люциферазы in vivo.Демонстрация того, что изменения биолюминесценции могут быть следствием действия ингибиторов фермента люциферазы, а не изменением уровней ATP in vivo. При выполнении данной процедуры важно учитывать, что соединения могут воздействовать непосредственно на активность фермента люциферазы светлячка, не влияя на энергетический статус червя. Следовательно, результаты могут быть подтверждены с помощью различных методов оценки митохондриальной функции, таких как, например, определение потребления кислорода, определение потенциала митохондриальной мембраны, определение активных форм кислорода или визуализация митохондрий в штаммах *C. elegans*.Митохондрии с GFP-меткой.

a-screenable-vivo-assay-for-mitochondrial-modulators-using-transgenic

Research

JoVE Journal

Biology

Биология

Процедура жидкой основе культивирования и...

Высокопроизводительный скрининг и биодатчиков с люминесцентными С. Элеганс Штаммы

Источник: Anderson, Q. L. et al. Высокопроизводительная система C. elegans на основе жидкой жидкости с высокой пропускной способностью. J. Vis. Exp. (2018)В этом видео демонстрируется высокопроизводительный метод скрининга с использованием Caenorhabditis elegans для изучения нокдаунов генов во время взаимодействия хозяина и патогена. В нем описана процедура подготовки нокдаун-червей и переноса их на пробирные планшеты для оценки эффектов индуцированного патогенами уничтожения червей.

Многолуночный анализ на жидкостной основе для скрининга нокдаунов C. elegans

Это видео демонстрирует анализ in vivo для изучения митофагии у Caenorhabditis elegans. После воздействия на нематод препарата, индуцирующего митофагию, возникновение митофагии оценивают по колокализации между DCT-1, рецептором митофагии на поврежденных митохондриях, и аутофагосомным мембранным белком LGG-1.

Анализ in vivo для выявления митофагии у трансгенных нематод

Имея небольшие прозрачные тела, хорошо документированный нейроанатомию и множество поддаются генетических методов и...

В естественных нейронных изображений кальция в C. Элеганс

Прион-подобное распространение белковых агрегатов в последнее время стало связано со многими нейродегенеративными заболеваниями. Цель этого протокола — описать, как использовать нематоду C. elegans в качестве модельной системы для мониторинга распространения белка и исследования прионоподобных явлений.

Исследуя распространение и токсичности прионами как белков с использованием многоклеточных животных модельного организма<em&gt; C. Элеганс</em

Генетически-кодируемый гистона-miniSOG индуцирует генома наследуемые мутации в голубой светло-зависимым образом. Этот метод мутагенеза является простым, быстрым, свободным от токсичных химических веществ, а также хорошо подходит для прямого генетического скрининга и интеграции трансгена.

Оптогенетика Случайные мутагенеза Использование гистона-miniSOG в<em&gt; C. Элеганс</em

Mitophagy, процесс очистки повреждения митохондрий, необходимых для митохондриального гомеостаза и медицинского обслуживания. В статье представлены некоторые из последних mitophagy методы обнаружения в клетки человека и Caenorhabditis elegans, мышей.

In Vitro и In Vivo обнаружения Mitophagy в клетки человека и C. Elegans, мышей

Здесь мы опишем простой протокол для быстро производить сотни нематоды роста СМИ агар, 96-луночных культуры пластин с последовательным числом Caenorhhabditis elegans за хорошо. Эти культуры являются полезными для фенотипического скрининг всего организмов. Мы сосредоточимся на использование этих культур экрана химических веществ для про долговечность эффектов.

Простой метод для высокой пропускной способности химического скрининга в Caenorhabditis Elegans

В этом исследовании представлены протоколы для двух полуавтоматических подходов к анализу локомоторной активности у червей C. elegans complex I disease gas-1(fc21),а именно ZebraLab (анализ со средней пропускной способностью) и WormScan (высокопроизводительный анализ) и сравнительный анализ среди широкого спектра методов исследования для количественной оценки поведения нематод и интегрированной нервно-мышечной функции.

Сравнительный анализ экспериментальных методов количественной оценки активности животных в моделях митохондриальной болезни Caenorhabditis elegans

Кишечные микробы могут положительно или отрицательно влиять на здоровье своего хозяина через определенные или сохраненные механизмы. Caenorhabditis elegans является удобной платформой для скрининга таких микробов. Настоящий протокол описывает высокопроизводительный скрининг 48 бактериальных изолятов на предмет воздействия на стрессоустойчивость нематод, используемых в качестве прокси для здоровья червей.

Высокопроизводительный скрининг микробных изолятов с воздействием на здоровье Caenorhabditis elegans

Этот протокол обеспечивает стандартизированный подход к визуализации морфологии митохондрий в нескольких тканях C. elegans во время старения.

Визуализация и количественная оценка морфологии митохондрий у C. elegans в период старения

Изучите скрининг модуляторов митохондриальной функции in vivo с использованием трансгенных Caenorhabditis elegans. Этот метод позволяет количественно оценивать уровни АТФ биолюминесценцией для выявления токсичности или полезных эффектов препаратов.

Скринируемый

Больше видео