Сэндвич-как микросреды, чтобы использовать Cell / Материал взаимодействий

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы собрать сэндвич-подобные культуры для изучения поведения клеток в более физиологически релевантной 3D-среде. Это достигается путем предварительной подготовки и покрытия вентрального и дорсального субстратов белками, такими как фибронектин. Затем клетки рассаживают аналогично стандартной 2D-культуре.

Затем дорсальный субстрат накладывается таким образом, чтобы клетки стимулировались вентрально и дорсально. Наконец, можно проводить такие эксперименты, как анализ заживления ран. В конечном счете, сэндвич-подобные культуры анализируются с помощью процедур, уже разработанных для стандартных 2D-культур, таких как живая визуализация, иммунофлуоресценция или клеточная экстракция.

Для дальнейшего анализа. Основное преимущество этого метода по сравнению с существующими трехмерными системами заключается в том, что он позволяет изучать различные параметры взаимодействия материалов, такие как топография, химический состав, жесткость и содержание белка как в вентральном, так и в дорсальном участках, что обеспечивает высокую степень универсальности. Помимо экспериментальных процедур, которые могут быть затруднены для некоторых трехмерных систем, таких как липин, иммунофлуоресценция и клеточная экстракция, легко выполнить: чтобы получить плоскую пленку полимолочной кислоты или PLLA методом литья растворителем, работающим в вытяжном шкафу, добавьте два грамма PLLA к 100 миллилитров хлороформа и перемешайте при комнатной температуре в течение примерно трех часов или до полного растворения.

Поместите шайбы из нержавеющей стали на стеклянную чашку Петри. Затем добавьте в стиральные машины 200 микролитров раствора PLLA. Используйте алюминиевую фольгу с несколькими отверстиями, чтобы накрыть блюдо, и дайте PLLA медленно испариться при комнатной температуре в течение 30 минут.

Затем нагрейте образцы до 120 градусов Цельсия в течение пяти минут, чтобы испарить любые следы растворителя. Затем, дав образцам остыть при комнатной температуре в течение примерно 30 минут, используйте воду с сопротивлением 18,2 мега Ом в сантиметре, чтобы покрыть образцы в чашке, и инкубируйте при комнатной температуре в течение восьми минут. После инкубации с помощью бритвенного лезвия снимите шайбы с чашки Петри.

Затем с помощью пинцета удалите любые дефекты с края шайб и дайте образцам высохнуть на воздухе. Поскольку PLLA поддается разложению при гидролизе, образцы в вакууме высыхают до дня проведения экспериментов. Кроме того, волокна ELLA могут быть изготовлены в соответствии с текстовым протоколом и использоваться в качестве дорсального субстрата под стерильным культуральным колпаком.

Добавьте в образцы 20 мкг на миллилитр FI нинин в docos PBS или DPBS с кальцием и магнием и инкубируйте при комнатной температуре в течение одного часа после белкового покрытия. Используйте DPBS для двукратной промывки образцов и храните в DPBS с P-кальцием и магнием до тех пор, пока не будут готовы к использованию следующие семенные клетки на стеклянной крышке, и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом в течение трех часов, чтобы клетки могли прилипнуть к вентральному субстрату. Затем переложите образцы в новые лунки 12-луночной пластины.

С помощью пинцета аккуратно наложите дорсальный субстрат на клетки. Затем добавьте один миллилитр среды. Вес шайбы не позволит спинному субстрату всплыть.

Верните образцы до 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом, меняя среду два раза в неделю, чтобы изучить миграцию клеток в культуре, похожей на бутерброд. После покрытия вентрального и дорсального субстратов фибронектином, как было показано ранее, семенные клетки на стеклянной крышке проскальзывают с высокой плотностью, инкубируют образцы и позволяют клеткам достичь слияния. Затем с помощью наконечника пипетки поцарапайте монослой клетки, чтобы создать две популяции клеток, разделенных зазором.

Поместите подваленный сидящий субстрат в новую лунку, подходящую для покадровой съемки и достаточно большую, чтобы внутрь поместились дорсальные субстраты. Затем с помощью пинцета, как было продемонстрировано ранее, наложите дорсальный субстрат на клетки и наполните средой. Поместите образец под покадровый микроскоп и каждые 20 минут делайте снимки закрытия зазора.

Используйте программное обеспечение, такое как mito BO от Image J, для анализа закрытия зазора в сэндвиче. Как и культура. Сульфат сильно зависит от времени стимуляции дорсальных рецепторов и от свойств дорсального взаимодействия.

Подобно другим 3D-системам, таким как гидрогели, например, как показано здесь, дорсальные электровращающиеся волокна PLLA напрямую выравнивают клетки при покрытии фибронектином, но не при покрытии неадгезивным белком, таким как BSA. Кроме того, сэндвич-подобные культуры с простой дорсальной PLLA вызывали повышение уровня миогенеза с использованием клеток C two C 12. Это также зависит от дорсальных биологических раздражителей.

Поскольку взаимодействие с различными дорсальными белками приводит к различным скоростям дифференцировки, как показано в этом видео, фибробласты, мигрирующие внутри бутерброда как культура в анализе заживления ран, принимают удлиненную морфологию и мигрируют на более короткие расстояния по сравнению с клетками. Культивируется на 2D субстратах, аналогичных 3D фибронектину и коллагеновым гелям. Сэндвич-подобное культивирование увеличивает клеточную опосредованную реорганизацию ЭКМ по сравнению с 2D-условиями.

Этот процесс зависит от дорсальных механических раздражителей и стабильности цитоскелета. Поскольку использование ингибиторов сократительной способности, таких как BLEs, статины препятствовали процессу S Хорошо, поэтому после просмотра этого видео у вас должно сложиться четкое представление о том, как собирать бутерброды, подобные культурам. Этот метод может создавать 3D-подобную микросреду для реакционной медицины и рака, включая приложения в моделях заболеваний, исследованиях разработок и тестировании лекарств.