Твердые липидов Наночастицы (SLNS) для внутриклеточного Ориентация Приложения

Общая цель этой процедуры заключается в синтезе ультрамалых популяций биосовместимых наночастиц, характеристике их физических свойств и исследовании взаимодействий клеток частиц. Это достигается путем использования метода фазовой инверсии температуры для синтеза липидных наночастиц. Во время этого процесса липид и поверхностно-активное вещество первоначально расплавляются.

После добавления определенного количества воды смесь нагревают до тех пор, пока не произойдет разделение фаз. Затем смесь непрерывно перемешивают до тех пор, пока не образуется наноэмульсия и не завершится синтез твердых липидных наночастиц или sln. Затем используется динамическое рассеяние света или DLS для измерения размера частиц и полидисперсии.

Дифференциальная сканирующая калориметрия или ДСК является дополнительным методом, используемым для определения температуры плавления и скрытой теплоты плавления с целью дальнейшей характеристики частиц, в конечном итоге флуоресцентная микроскопия и проточная цитометрия могут быть использованы для исследования взаимодействий клеток частиц. Основное преимущество этого метода перед существующими методами высоких энергий, такими как ультразвуковая микрофлюидизация и гомогенизация под высоким давлением, заключается в том, что это сравнительно щадящий метод синтеза, который является одновременно простым и масштабируемым. Для синтеза LNS соединяют 0,6 миллиграмма флуоресцентного красителя или другого липофильного соединения и 0,10 грамма линейного алкана или липида.

В 15-миллилитровый флакон ядро расплавить компоненты при температуре 90 градусов Цельсия и, перемешав, добавить 0,11 грамма линейного неионогенного поверхностно-активного вещества. Затем измельчите полученную смесь при температуре 90 градусов Цельсия и перемешайте. Далее добавьте в смесь 1,79 грамма стерильной воды, нагрейте до 90 градусов Цельсия и визуально следите за раствором до тех пор, пока не будут наблюдаться две фазы.

Теперь перемешайте смесь до образования прозрачной наноэмульсии. Параллельно приготовьте отдельную наноэмульсию без добавления флуоресцентного красителя, чтобы она служила контрольным образцом. Далее стерилизуйте каждую наноэмульсию с помощью стерильного фильтра 0,2 микрона.

Используйте DLS для измерения размера частиц и полидисперсии S lns с помощью стекла в конструкции прибора Для измерения размера частиц Перед измерением образцов размер частиц двух известных стандартов должен быть измерен в соответствии с протоколом производителя по подготовке стандартов и измерению. Затем измерьте образцы в том виде, в каком они были подготовлены для каждого из них. Используйте время работы 100 секунд, показатель преломления воды и вязкость воды при температуре 20 градусов Цельсия.

Сообщите о среднем диаметре частиц и полидисперсности распределения частиц по размерам для исследования тепловых характеристик S LNS с помощью DSC: сначала пипетка S LNS в алюминиевую чашку объемом 40 микролитров массой около 25 миллиграммов. Герметично запечатайте сковороду с помощью универсального обжимного пресса, чтобы свести к минимуму потерю влаги во время сканирования ДСК. Перед измерением каждой наноэмульсии от пяти до 80 градусов Цельсия сообщите о температуре плавления и скрытой теплоте плавления на графике DSC, где долина представляет собой точку плавления и интеграл площади под кривой.

На графике ДСК, деленный на количество материала, представляет скрытую теплоту плавящейся культуры. Первичные фибробласты человека в соответствии с инструкцией производителя в жидкой среде для культивирования дермальных фибробластов человека. В сочетании с набором добавок с низким уровнем роста сыворотки поддерживайте клетки во влажной атмосфере при температуре 37 градусов Цельсия, 5% углекислого газа и субкультуре при достижении 80% слияния как для МТТ, так и для анализа изображений затравочных клеток.

В 96 луночных планшетах с плотностью 20 000 ячеек на лунку. Дайте клеткам уравновеситься при 37 градусах Цельсия в течение ночи перед воздействием SLN, в момент нулевого разбавления S SLM в полной среде для достижения желаемой концентрации липидов и добавьте 10 микролитров на лунку в каждую повторяющуюся лунку в 96-луночном планшете после 24 часов инкубации с S lns, определите клеточную жизнеспособность с помощью анализа MTT в соответствии с протоколом производителя. Промойте клетки один раз и добавьте в каждую по 100 микролитров свежей среды.

Хорошо убейте контрольные лунки путем инкубации в 70%-ном растворе метанола в течение 10 минут перед заменой на свежую среду. Добавьте реагент МТТ по 10 микролитров на лунку в каждую лунку микропланшета и после ночной инкубации инкубируйте в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия, растворите внутриклеточную форму и кристаллы в 100 микролитрах предоставленного раствора моющего средства. Согласно протоколу производителя, инкубируйте клетки в растворе моющего средства в течение трех часов при комнатной температуре до получения значений абсорбции.

Использование считывателя микропланшетов для подготовки к микроскопии. Дважды промойте фибробласты стерильным фосфатным воздушным раствором. Зафиксируйте клетки на 10 минут холодным 70% метанолом в определенные моменты времени после дозирования фибробластов с LN.

Через 10 минут замените метанол на фосфатно-солевой буфер или PBS перед получением изображений с помощью инвертированного микроскопа. Синтезированный S SLN привел к получению контрольных S LNS со средним диаметром частиц 18,59 и полидисперсией 5,83 и SLM с нильской красной нагрузкой со средним диаметром частиц 16,87 нанометров и полидисперсией 4,47 с использованием анализа МТТ. Измеряли влияние реакции на клеточный метаболизм в тех случаях, когда увеличение концентрации частиц приводило к снижению жизнеспособности клеток.

Не наблюдалось разницы в токсичности между клетками, подвергшимися воздействию только SLN, и клетками, нагруженными нильским красным веществом. СЛН. Параллельно клетки визуально исследовали на предмет адгезии к тканевой культуре. Полистирол и изображения были сделаны для демонстрации как репрезентативной клеточной морфологии, так и поглощения флуоресцентных частиц с течением времени с использованием дозы, равной пяти микрограммам на миллилитр.

Поглощение липидных частиц наблюдалось через два часа после воздействия. Уровень включения наночастиц определяли путем измерения интенсивности красной флуоресценции Нила в дендритных клетках костного мозга мышей, или B-MDC, с помощью проточной цитометрии. Наблюдалась прямая корреляция между концентрацией используемых СНС и величиной флуоресценции, оцениваемой в В-МДХ.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как синтезировать ультрамалые популяции биосовместимых наночастиц, охарактеризовать их физические свойства и исследовать взаимодействия клеток частиц.