Cryosectioning Метод микродиссекции мышиной слизистой оболочки толстой кишки

Общая цель этой процедуры заключается в микродиссекции двух пространственно различных областей толстой кишки, пролиферативной крипты К и дифференцированных поверхностных эпителиальных клеток. Это достигается путем предварительного удаления толстой кишки мыши. Вторым этапом является замораживание ткани между двумя металлическими пластинами.

Далее ткань монтируется на предварительно выровненную ОКТ-блокаду. Заключительным этапом является разрезание ткани на криостате с интервалом 10 микрон. В конечном счете, ПЦР в реальном времени или вестерн-блоттинг используется для отображения изменений в экспрессии генов и белков.

Преимущество нашей методики в том, что она быстрая, недорогая и высокопроизводительная демонстрация. Наша процедура – это Кристиан Гарнер Шмидт, техник в нашей группе. Все процедуры с использованием животных были рассмотрены и одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию Университета Эмори и выполнены в соответствии с критериями Национальных институтов здравоохранения.

После настройки криостата, как обычно, уравновесьте лопасти и патроны криостата до минус 20 градусов Цельсия. Затем заполните пустую криоформу составом с оптимальной температурой резки и уравновесьте до минус 20 градусов Цельсия. Это займет примерно 30 минут.

Извлеките замороженный ОКТ из формы и закрепите его на патроне с помощью жидкого ОКТ. Поместите патрон в кронштейн микротома и дайте ОКТ застыть в течение 10 минут. Установите криостат на 10 микрон на секцию и брейте блок ОКТ до тех пор, пока он не станет плоским, отодвинув руку микротома от лезвия на несколько сантиметров.

Далее подготовьте по два бритвенных лезвия на пробу с помощью металлического напильника, затупите острые края лезвий. Затем снимите алюминиевый фланец с помощью щипцов. Приготовьте 10-сантиметровую чашку для культуры тканей, заполненную на 50% силиконом, и с 10-15 рассекающими штифтами.

Добавьте пять миллилитров комнатной температуры, добавьте в блюдо буфер после усыпления мыши по утвержденным методам и иссечения дистального сегмента ободочной кишки на расстоянии от нуля до шести сантиметров от анального отверстия. Для резки используйте ножницы. Вскройте толстую кишку в продольном направлении и удалите каловое содержимое.

Прикрепите ткань к силиконовой чашке для препарирования, содержащей буфер Хэнка, поверхностью слизистой оболочки вверх. Растяните ткань с помощью рассекающих штифтов. Затем дайте ему отдохнуть в течение 10 минут при комнатной температуре, чтобы удалить складки с ткани и дать возможность мышечным слоям расслабиться.

Действует после того, как ткань отдохнет, удалите все, кроме торцевых штифтов. Проведите лезвием бритвы под нужный участок ткани, а затем слейте с мотков буфер. Добавьте еще одно лезвие бритвы сверху, сделав бутерброд.

Разрежьте тканевый сегмент и удалите торцевые булавки. Переложите бутерброд с салфеткой бритвенного лезвия на сухой лед. Дайте ткани застыть в течение пяти-10 минут.

Возьмите бутерброд с бритвенной салфеткой и дайте ему немного нагреться, положив палец на верхнее лезвие. Отделите бутерброд и разрежьте по краям тканевый сегмент. Разрезание отрезка ткани примерно 0,5 сантиметра на один сантиметр.

Дайте ткани нагреться до тех пор, пока лед поверх ткани не начнет таять. На этом этапе быстро и осторожно вдавите ткань в ОКТ-блок. В криостат поместите палец над образцом.

Теплопередача позволит снять лезвие, не нарушая ткани. Покройте ткань ОКТ и дайте ей сбалансироваться в течение пяти минут. Затем нарезаем срезы по 10 мкм.

Положите срезы на предметное стекло и визуально осматривайте срезы, пока не будут видны склепы. Поместите срезы в тубах объемом 1,5 миллилитра или на предметных предметах. На этом изображении показана ткань толстой кишки, окрашенная гематином эоином в традиционном поперечном сечении с круговой мышцей, обозначенной как cm.

Слизистая оболочка мышц, меченная ММ, хорошо видны клетки основания крипты, переходные клетки и поверхностные клетки. На этом изображении показана круговая мускулатура после серийного разрезания. По мере продвижения к поверхностным клеткам видна слизистая оболочка мышц

На этом изображении показаны окрашенные h и D клетки основания крипты при большем увеличении. Обратите внимание на отсутствие центрального просвета. Здесь видны переходные ячейки, а на этом изображении показаны поверхностные клетки.

На следующих изображениях показано иммунофлуоресцентное окрашивание изолированных крипт толстой кишки для окрашивания белка клеточного соединения. Окклюдин Soula one или ZO one выглядит зеленым, а ядра, которые кажутся синими, наблюдаются в поперечном сечении. Переходные и поверхностные ячейки показаны здесь после последовательного разрезания.

Несколько факторов дифференцировки выражаются пространственно-временным образом вдоль оси поверхности крипа. Это включает в себя фактор транскрипции, похожий на фактор четыре, показанный зеленым цветом, который обогащен поверхностными клеточными популяциями при просмотре в поперечном сечении. Наконец, этот вестерн-блот демонстрирует уровни белка KLA 4 в этих клеточных популяциях.

Не забывайте, что работа с микротоновыми лезвиями может быть чрезвычайно опасной, поэтому будьте особенно осторожны при выполнении этой процедуры.