Исследуя функциональное Регенерация в Органотипической спинного мозга сопредседателей культур, выращенных на нескольких электродов массивов

Общей целью данного эксперимента является изучение функциональной регенерации интраспинальных связей в органотипических культурах спинного мозга с использованием мультиэлектродных матриц, так называемых meas. Это достигается за счет культивирования двух поперечных срезов спинного мозга рядом друг с другом на лугах для имитации внутриспинальных связей между различными сегментами спинного мозга. В пробирке срезы растут и в течение нескольких дней in vitro срастаются по бокам лицом друг к другу.

В качестве второго шага. Поражения выполняются через разные сроки в культуре, что приводит к полному разделению срезов. Далее культуры оставляют в инкубаторе минимум на две недели.

Для того, чтобы дать спинномозговым сетям время для регенерации, всплеск активности между двумя срезами показывает, что культуры, поврежденные в раннем возрасте, демонстрируют высокий потенциал функциональной регенерации, в то время как эта способность явно снижена в культурах, поврежденных в более позднем возрасте. Основное преимущество этой методики перед существующими методами, такими как срезы, культивируемые на мембранах, диссоциированные культуры или в BSA, заключается в том, что комбинация типичных культур Ergon с многоэлектродными решетками позволяет оценить функциональные аспекты регенерации в микроокружении спинного мозга с прямым экспериментальным доступом. Простерилизуйте многоэлектродные матрицы, промыв их в течение 30 секунд, дважды в 100% этаноле, один раз в 70% этаноле, а затем дважды в дистиллированной воде. После высыхания поместите от 10 до 12 массивов в стеклянную чашку Петри и закройте крышку после того, как вы автоклавируете массивы на 20 минут при 120 градусах Цельсия.

Поместите каждую многоэлектродную решетку в отдельную стерильную чашку Петри диаметром 35 мм. Достаньте остывшую пипетку из морозилки. С его помощью на электрод нанесите 150 микролитров охлажденного раствора покрытия внеклеточного матрикса.

Закройте крышку чашки Петри и выдержите массив в течение одного часа при комнатной температуре. Примерно через 10 минут проверьте наличие пузырьков воздуха на верхней части электродов и аккуратно удалите их резиновым шпателем. При необходимости проверьте на исчезновение всех пузырьков.

Далее отсасывайте раствор покрытия. Промойте салфетку средством, оптимизированным для пренатальных и эмбриональных нейронов, а затем дважды промойте их дистиллированной стерильной водой. После полоскания дайте им постоять при комнатной температуре до полного высыхания.

Сразу после извлечения у матери перенесите обезглавленные эмбрионы крысы Е 14 в чашку Петри, наполненную стерильным охлажденным раствором для мытья. Выполните один полный поперечный разрез скальпелем над задними конечностями и другой над четырьмя конечностями, а также удалите конечности от тела. Далее сделайте разрез во фронтальной плоскости, чтобы отделить внутренности от задней части, содержащей спинной мозг.

Затем перенесите задние части, содержащие спинной мозг, по одной на монтажный диск. Разрежьте спинной мозг толщиной от 225 до 250 микрон с помощью измельчителя тканей. Затем капните каплю моющего раствора на измельченную ткань и переложите ломтики в чашки Петри размером 35 на 10 миллиметров, наполненные стерильным охлажденным раствором для умывания.

Рассеките спинной мозг вдали от остатков тканей на каждом из срезов. Следите за тем, чтобы ганглии дорсального корешка оставались прикрепленными. Переложите ломтики в чашку Петри размером 35 на 10 миллиметров, наполненную стерильным охлажденным раствором для мытья посуды.

Затем дайте ломтикам отдохнуть в течение часа при температуре четыре градуса Цельсия. Поместите внутрь под стереомикроскоп чашку Петри с микроэлектродной матрицей с покрытием. Сфокусируйте массив и отцентрируйте его.

Капля куриной плазмы объемом шесть микролитров на электродной решетке. С помощью небольшого шпателя в каплю плазмы осторожно продеваются два отрезка спинного мозга так, чтобы их вентральный размер был обращен друг к другу. Далее на восемь микролитров тромбина вокруг куриной плазмы капли.

Затем с помощью наконечника пипетки тщательно перемешайте и распределите курицу, плазму и тромбиновую смесь. Непосредственно перед тем, как куриная смесь плазмы и тромбина становится слишком тягучей и начинает свертываться, отсасывайте лишнюю жидкость, затем закрывайте чашку Петри крышкой и помещайте ее во увлажненную камеру. Поместите камеру внутрь инкубатора при температуре 37 градусов Цельсия примерно на час После инкубации осторожно добавьте в образец 10 микролитров питательной среды.

Закройте чашку Петри крышкой и поместите ее обратно в инкубатор еще на 45 минут. Затем поместите каждую из культур с многоэлектродной матрицей в роликовую трубку и добавьте три миллилитра питательной среды. Плотно закройте крышку и поместите роликовую трубку в роликовый барабан.

Поверните барабан на одну-две РРЦ М в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия с помощью стерильных щипцов с резиновым наконечником. Извлеките сборки культур с многоэлектродной матрицей из роликовой трубки и поместите их в чашку Петри под стереомикроскопом. Сфокусируйте ткань и убедитесь, что два среза срослись.

Затем удерживайте узел неподвижно и поместите лезвие скальпеля в паз многоэлектродной матрицы. Близко к тканевым срезам. Держите скальпель довольно горизонтально, а затем поднимите рукоятку скальпеля вверх.

Но пусть лезвие скальпеля остается в пазу массива таким образом, чтобы лезвие катилось от основания к кончику, прорезая ткань, охватывая канавку. При необходимости оборвите все остаточные тканевые соединения кончиком иглы 25 калибра, работайте только в области внутри канавки и не касайтесь нежных краев. Поместите сборки культур с многоэлектродной матрицей обратно в роликовую трубку и добавьте к культурам три миллилитра свежей питательной среды.

Затем поместите роликовую трубку обратно на роликовый барабан в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия. Установите культуральную сборку с несколькими электродами в записывающую камеру и нанесите на матрицу около 500 микролитров внеклеточного раствора. Затем установите сборку на микроскоп.

Подождите 10 минут, пока система стабилизируется, а затем записывайте основную спонтанную активность каждого из электродов, обнаруживающих активность, в течение 10 минут. Повторите записи в общей сложности два раза, чтобы обеспечить стабильные внеклеточные условия. При желании заменяйте внеклеточный раствор после каждого сеанса записи.

Растормаживайте сеть путем применения внеклеточного раствора, содержащего один микромоляр строгих девяти и 10 микромоляров газина, и подождите не менее двух минут перед регистрацией электрической активности, чтобы исследовать потенциал функционального восстановления сокультур, полученных из спинного мозга эмбрионов крыс типа E 14. Поражения выполнялись в течение периода от восьми до 28 дней in vitro. Через две-три недели была зарегистрирована спонтанная нейронная активность.

С помощью многоэлектродной матрицы исходные данные затем преобразуются в растровые графики, за которыми следуют графики сетевой активности, чтобы визуализировать общую активность отдельно для каждой стороны в каждом срезе. Спонтанная активность обычно организована в виде всплесков, показанных здесь, при растормаживании срезы, которые были разделены в молодом возрасте, выступают здесь как функционально связанные. Однако те, кто разлучен в более старшем возрасте, кажутся асинхронными.

Используя эту информацию, можно определить и визуализировать количество синхронизированных пакетов между срезами в разном возрасте, как показано ниже. Другие методы, такие как иммуногистохимическое окрашивание, могут быть выполнены, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, какие типы клеток вносят вклад в функциональную связь между двумя срезами спинномозговой кварты.