Раннее проникновение вируса Анализы для идентификации и оценки антивирусных соединений

Общая цель данной процедуры заключается в определении противовирусного эффекта исследуемых соединений против конкретных этапов раннего проникновения вируса. Это достигается путем предварительного засеивания клеток-хозяев вирусной инфекцией. Вторым шагом является проведение обработки вирусной инфекцией и тестируемым соединением в разное время и при разных температурах.

Далее обработанные препаратом инокулюмы смываются и на клетки накладывается базальная среда. Заключительным этапом является инкубация клеток. В конечном счете, вирусная инфекционность анализируется для определения влияния тестируемых соединений на ранние этапы проникновения вирусной инфекции.

Например, люминометр используется для оценки активности люциферазы в клеточном снате от инфицирования репортерным вирусом. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он может обеспечить более механический подход к выявлению противовирусных препаратов, особенно тех, которые нацелены на проникновение вируса. Для начала, во-первых, приготовьте исходные растворы исследуемых соединений, трилогической кислоты или CHLA и PUNIC коллагена или PUG в ДМСО растворяют гепарин для положительного контроля в стерильной воде двойной дистилляции для подготовки клеток хозяина к анализу культуры.

Гепатокарцинома человека, HUH 7,5 клеток на ночь в свежем DMAM с добавлением FBS и антибиотиков. Не забывайте следовать процедурам второго уровня биобезопасности на протяжении всего эксперимента, чтобы проверить цитотоксичность исследуемых соединений. Обрабатывайте клетки возрастающими концентрациями CHLA или PUG от нуля до 500 микромоляров, разведенных в базальной среде, или 1% ДМСО в качестве отрицательного контроля, а затем инкубируйте клетки в течение 72 часов при 37 градусах Цельсия в инкубаторе для клеточных культур.

Удалите среду и промойте клетки 200 микролитрами PBS дважды. Далее добавьте 100 микролитров реагента для анализа XT T, и выдерживайте при температуре 37 градусов Цельсия в течение трех часов. Затем используйте микропланшетный ридер для определения поглощения на 492 нанометрах с опорной длиной волны на 690 нанометрах.

Рассчитайте процент жизнеспособности по заданной формуле из этих значений. Определите 50%-ную концентрацию клеточной цитотоксичности для каждого соединения. Для начала проводится анализ вирусной инактивации.

Первая пластина, по одной раз по 10 на четвертую ячейки на лунку. В 96-луночном планшете инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом в течение ночи для прикрепления к инфекции. Подготовьте репортер Gaia luciferaza, помеченный вирусом гепатита С или частицами HCV, как указано в текстовом протоколе.

В стерильной пробирке смешать 100 микролитров 100 микромолярных CHLA или PUG со 100 микролитрами 10 до четверти. Блоки формирования фокуса или FFU HCV для положительного контроля смеси. ВГС с гепарином в конечной концентрации 1000 мкг на миллилитр.

Выдерживать при температуре 37 градусов Цельсия в течение трех часов. Через три часа разведите смесь вирусного соединения в 50 раз с 9,8 миллилитрами базальной среды комнатной температуры. Затем приготовьте новую смесь соединений вируса, и немедленно разведите эту смесь в базальной среде для образца инкубации нулевого часа.

После удаления инкубационной среды из клеток добавьте 100 микролитров разведенного раствора вирусного препарата на лунку в трех экземплярах. Раствор теперь содержит от 10 до 2 FFU на лунку, инкубировать при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение трех часов, чтобы предотвратить вирусное заражение клеток. После инкубации удалите вирусную суспензию из лунок и аккуратно промойте клетки 200 микролитрами PBS. Дважды.

Инкубируйте клетки в 100 микролитрах базальной среды в течение 72 часов для репликации вируса и высвобождения люциферазного репортера в надосадочную жидкость. Затем соберите супернат из культур и микропробирок и центрифугируйте при 17 000 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Чтобы удалить клеточный мусор, смешайте по 20 микролитров каждого суперната с 50 микролитрами реагента для анализа люциферазы Гаусси-люциферазы и измерьте люминесценцию от репортерной активности люциферазы в люминометре.

Согласно инструкции производителя к планшету для анализа вирусного прикрепления, один раз от 10 до четвертой клетки на лунку. В 96-луночной пластине и инкубировать в течение ночи для прикрепления клеток на следующее утро. Сначала охладите 96-луночный планшет, содержащий монослой клетки, при температуре четыре градуса Цельсия в течение одного часа.

Приготовьте исследуемые соединения и вирусную смесь на льду. Например, H-C-V-C-H-L-A-H-C-V 1% ДМСО или растворы гепарина ВГС положительного контроля с 10 ко второму вирусу FFU. Для каждой обработки хорошо отсасывайте среду из клеточной культуры мягко

Затем сразу же добавьте 100 микролитров тестовой смеси вируса в тройные лунки, стараясь не повышать температуру. Выдержите тарелку в холодильнике, поддерживаемом при температуре четыре градуса Цельсия, в течение трех часов. Вирусные частицы будут прикрепляться к сотовой сети при температуре четыре градуса Цельсия, но не будут интернализованы.

Далее отсасывайте надосадочную жидкость. Аккуратно промойте клетки дважды 200 микролитрами ледяного льда. PBS добавляют по 100 микролитров базальной среды в каждую лунку, а затем инкубируют при температуре 37 градусов Цельсия в течение 72 часов.

Наконец, для количественного определения высвобождения люциферазы из инфицированных клеток. Соберите супернат из каждого образца и выполните анализ люциферазы Гаусса для определения слияния вирусов и их проникновения. Предварительно охладите планшет для клеточной культуры при температуре четыре градуса Цельсия в течение одного часа.

После ночной инкубации для прикрепления клеток удалите имеющуюся среду из лунок и заразьте клетки 10-секундным F-F-U-H-C-V на льду. Выдерживайте тарелку при температуре четыре градуса Цельсия в течение трех часов. Аккуратно промойте клетки дважды 200 микролитрами ледяного PBS, чтобы удалить вирус, не прилипший к AD.

Затем на льду обрабатывают клетки исследуемыми соединениями, растворенными в базальной среде или базальной среде с 1% ДМСО в качестве контроля, и инкубируют планшет при 37 градусах Цельсия в течение трех часов. Это позволяет оценить тестируемые соединения по проникновению вируса, которое происходит при 37 градусах Цельсия. Отсадите среду и дважды промойте неинтернализованные вирусы 200 микролитрами цитратного буфера или PBS.

Добавьте 100 микролитров базальной среды в лунку и выдерживайте при температуре 37 градусов Цельсия еще 72 часа. Соберите супернат и выполните анализ люциферазы Гаусса, как было показано ранее для обнаружения высвобожденного люциферазного репортера. Ниже приведены эффекты исследуемых соединений на ВГС. При активации вирус инкубировался с исследуемыми соединениями в течение нуля или трех часов до заражения.

Процент ингибирования вирусной инфекции строится на графике для каждой процедуры. Отрицательный контролируемый ДМСО не проявляет ингибирования. CHLA проявляет высокую ингибицию при контакте, после нулевой инкубации, а также после более длительной инкубации в течение трех часов.

Дополнительные результаты с помощью другого теста. Здесь показано соединение PUG, адаптированное к этому общему экспериментальному дизайну, CHLA и PUG дополнительно ингибируют инфекционность цитомегаловируса человека или HCMV в эмбриональных фибробластах легких. Влияние CHLA и PUG на прикрепление HCV показано здесь.

Напомним, что клетки инкубировали с вирусом в присутствии или отсутствии исследуемых соединений при четырех градусах Цельсия, а затем удаляли несвязанные клетки вируса инкубировали при 37 градусах Цельсия для заражения вирусом. Закрашенные столбцы демонстрируют влияние C-H-L-A-P-U-G или гепарина на поступление ВГС в клетки. Отметим, что в данном случае вирусное прикрепление сначала осуществлялось при четырех градусах Цельсия.

Затем, после удаления несвязанного вируса, клетки инкубировали с тестовыми соединениями при температуре 37 градусов Цельсия для проникновения вируса. Аналогичным образом, в случае HCMV, инфицирование эмбриональных фибробластов легких лечением CHLA или PUG показывает сильное ингибирование прикрепления вируса и его проникновения. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о выполнении действий при указанной температуре, что повлияет на точность результатов.