Расшифровка и визуализации патогенез и запи- Микобактерии abscessus У эмбрионов данио рерио

Общая цель этой процедуры заключается в изучении и сравнении вирулентности штаммов Mycobacterium abscessus, а также в описании взаимодействия между этими бактериями и врожденной иммунной системой хозяина in vivo с использованием прозрачных эмбрионов рыбок данио. Это достигается путем предварительной подготовки гомогенного бактериального инокуляра. Затем эмбрионам внутривенно вводят бактериальные суспензии через 30 часов после оплодотворения.

Кроме того, для более точного изучения роли макрофагов в инфекционном контроле используется процедура инъекции на основе липохоата для получения истощенных макрофагами эмбрионов. Наконец, инфицированные эмбрионы подготавливают и визуализируют с помощью флуоресценции и конфокальной микроскопии для мониторинга прогрессирования инфекции. В конечном счете, результаты, которые могут быть получены, показывают специфические взаимодействия между флуоресцентными фагоцитарными клетками и M. abscessus, либо в виде отдельных базисов, либо в виде змеевидных тяжей внутри прозрачного эмбриона.

Основное преимущество использования рыбок данио по сравнению с другими животными моделями, такими как мыши, заключается в том, что они позволяют целенаправленно исследовать процесс инфекции в режиме реального времени и изучать конкретные взаимодействия между абсцессами микробактерий и микрофагами или нейтрофилами. Этот шаг является критическим для последующего давления впрыска у рыбок данио. В связи с высокой склонностью шершавой микобактерии абсцесс образовывать крупные агрегаты и образовывать коды, поэтому необходимо специальное лечение для подготовки однородного и количественно контролируемого инокуляра перед микроинъекцией.

Для приготовления м абсцесса, инокулярного сбора урожая экспоненциально выращивают культуры из 150 квадратных сантиметровых тканевых культур в стерильные пластиковые пробирки объемом 50 миллилитров и центрифугируют при 4000 G и комнатной температуре в течение 15 минут. Используйте один миллилитр Миддлбрука семь Н 9, дополненный обогащением OADC, плюс твин 80 в дальнейшем именуемый семь Н девять сред для ресуспендирования гранул и Элоку. 200 микролитров бактериальных суспензий в 1,5 миллилитровые пробирки с помощью иглы 26 калибра гомогенизируют каждый квадроцикл бактериальной суспензии ALI 15 раз.

Затем с помощью водяной бани обработать ультразвуком три раза по 10 секунд каждый с десятисекундными перерывами. В промежутках добавьте один миллилитр семи Н девять, средний и кратковременный вихрь, затем центрифугируйте при 100 G в течение трех минут. Осторожно соберите микобактерии, содержащие надосадочную жидкость, чтобы избежать скопления комков, и стяните однородные суспензии в стерильную пластиковую пробирку объемом 50 миллилитров.

Центрифугируйте суспензию при 4000 умноженных на G в течение пяти минут и используйте 200 микролитров семи Н 9 среды для ресуспендирования гранул для оценки конечного бактериального инокулята. Согласно текстовому протоколу, визуальная демонстрация этого метода, имеет решающее значение, так как этапы сложны для освоения, потому что точные щадящие манипуляции с инъекцией эмбрионов рыбок данио под микроскопом, а также освоение техники микроинъекции требовали времени для проведения микроинъекции M. абсцесса примерно через 24 часа. После оплодотворения или HPF используйте пинцет, чтобы покрыть эмбрионы в 100-миллиметровой чашке Петри и поддерживать их при температуре 28,5 градусов по Цельсию.

Перенесите 30 48 эмбрионов HPF в V-образную камеру позиционирования, заполненную 25 миллилитрами рыбьей воды, содержащей 270 миллиграммов на литр трики с обрезанным наконечником микрозагрузчика. Правильно заложите эмбрионы в каналы для облегчения манипуляций. Используйте PBST с 0,05% от 80, чтобы разбавить микробактериальный инокулюм до желаемого КОЕ, который должен быть доставлен, и добавьте 10% фенолового красителя, чтобы проверить правильность впрыска с помощью наконечника микрозагрузчика.

Загрузите в иглу для микроинъекций от 5 до 10 микролитров бактериального посева. Подсоедините иглу для микроинъекций к держателю микроманипулятора, подключенного к инжектору, и с помощью тонкого пинцета отломите верхнюю часть иглы. Для получения диаметр отверстия составляет от пяти до 10 микрометров.

Откалибруйте объем впрыска, отрегулировав давление и время микровпрыска. Затем, чтобы получить необходимый объем инъекции, измерьте диаметр капли, выброшенной в желток одного эмбриона, для микроинъекции в вену початка. Расположите эмбрион вентральной стороной к игле и поместите кончик иглы близко к мочеполовому отверстию.

И аккуратно протолкните кончик иглы в зародыш до тех пор, пока он не проткнет область жилы няни. Затем подайте желаемый объем бактериальной суспензии, обычно от одного до трех нанолитров, содержащих около 100 КОЕ на нанолитр. Инкубация и наблюдение за эмбрионами согласно текстовому протоколу для проведения липо Чоата, истощение макрофагов и эмбрионов при 24 HP. Судьба, эмбрионы, и перенесите их в инъекционную чашку, наполненную рыбьей водой с трикой.

Затем ориентируйте их спинной стороной вниз. После вортексирования инкапсулированного липосомами раствора клодроната загрузите микрокапиллярную иглу и откалибруйте объем инъекции. Проколите область вздутой вены, как было показано ранее, и введите два-три литра раствора.

Повторите инъекцию три раза. Инкубируйте эмбрионы при температуре 28,5 градусов Цельсия и используйте флуоресцентную микроскопию для контроля надлежащего истощения макрофагов перед инфекцией. Как показано ранее в этом видео, необходимо перечислить колониеобразующие единицы или КОЕ в нужный момент времени.

Соберите пять эмбрионов для каждого инфекционного состояния и перенесите каждый эмбрион в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров. Криоанестезия эмбрионов путем инкубации на льду в течение 10 минут после усыпления эмбрионов с концентрацией от 300 до 500 миллиграммов на литр. Трика. Используйте стерильную воду, чтобы дважды промыть эмбрионы в новой пробирке.

Затем, после удаления воды в концентрации 2% Тритон Х 100 в одном XPBS каждому эмбриону, и с помощью иглы 26 калибра гомогенизируйте ткань для полного лизиса. После центрифугирования суспензии используйте одну X-P-B-S-T для ресуспендирования гранулы. Затем пластину серийного разведения гомогенного на Миддлбруке семи H 10 OADC.

При добавлении B-B-L-M-G-I-T Panta инкубирует планшеты при температуре 30 градусов Цельсия в течение четырех дней перед подсчетом колоний для визуализации инфекции M. abscessus в реальном времени, монтирует эмбрионы под наркозом в 1% с низкой температурой плавления в чашку Петри со стеклянным дном 35 мм для инвертированного микроскопа или предметное стекло с одной полостью для вертикальной конфокальной микроскопии. Сориентируйте эмбрион в нужное положение и накройте застывший арос рыбьей водой, содержащей трику, для фиксации инфекции M. abscessus. После усыпления эмбрионов переложите их в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 миллилитра, и зафиксируйте эмбрионы в 4%-ном параформном альдегиде в одном X-P-B-S-T на два часа.

При комнатной температуре удалите параформный альдегид, дважды промыв эмбрионы одним X-P-B-S-T в течение 10 минут для сохранения целостности тканей и последовательной флуоресценции. Инкубируйте эмбрионы в возрастающей концентрации раствора глицерина в течение 10 минут для каждого условия. Поместите эмбрион, погруженный в 50% глицерин, в смотровую камеру.

Наконец, используйте флуоресцентный микроскоп с 10-кратным объективом или флуоресцентный конфокальный микроскоп с 40-кратным или 63-кратным объективом для последовательного получения флуоресцентной и просвечивающей визуализации эмбриона. Для исследования и сравнения вирулентности шероховатых и гладких вариантов M. абсцессус флуоресцентные бактерии были введены внутривенно 30 эмбрионам, способным к HPFC. В отличие от гладкого варианта, грубый индуцирует более сильную и летальную инфекцию с развитием абсцессов в центральной нервной системе.

Различия в вирулентности количественно оценивали либо путем перечисления КОЕ, либо путем определения количества флуоресцентных пикселей, которые коррелируют. Как видно на этом рисунке, кинетику образования спинного мозга можно контролировать и визуализировать с помощью видеомикроскопии неинвазивным способом, демонстрируя склонность грубого варианта к внеклеточной репликации, как показано здесь. Инфицирование истощенных макрофагами эмбрионов шероховатым M. абсцессом приводит к значительному увеличению бактериальной нагрузки и продукции пуповины, а также к быстрой гибели личинок.

Это ясно указывает на то, что макрофаги необходимы для контроля инфекции M. abscessus, чтобы наблюдать в режиме реального времени взаимодействие между макрофагами и M. abscessus. Можно использовать трансгенную линию EG one M вишни, которая производит красные флуоресцентные макрофаги. Инфекции вызывают заметное пополнение макрофагов с эффективным фагоцитозом отдельных бактерий, в то время как микобактериальные тяжи представляют собой стратегию, разработанную абсцессами, чтобы избежать фагоцитоза после их развития.

Этот метод проложил путь к изучению важной роли кодирования как нового механизма уклонения от иммунитета. Благодаря родинке данио-рерио инфекции теперь становится возможным наблюдать и описывать in vivo вклад кодов в патогенез абсцессов микобактерий.