Подготовка митохондриальных Обогащенный фракций для метаболического анализа в

Общая цель следующего эксперимента заключается в получении обогащенных митохондриальных фракций, содержащих достаточное количество митохондриальных метаболитов для метаболомных исследований с использованием drosophila melanogaster. Для этого сначала выращивается достаточное количество мух, чтобы обеспечить получение нужного объема метаболитов для обогащенных митохондриальных фракций. На втором этапе мухи гомогенизируются в стеклянном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком, что позволяет разрушить клеточные мембраны, не нарушая целостность митохондрий.

Затем гомогенаты подвергают дифференциальному центрифугированию для получения обогащенных митохондриальных образцов. Результаты показывают, что с помощью данного протокола были обнаружены выраженные изменения митохондриального метаболизма, которые не были выявлены при метаболомном анализе, основанном исключительно на митохондриально-обогащенных фракциях и экстрактах целых животных. Основным преимуществом данной процедуры по сравнению с метаболомным анализом целой мухи является то, что выделение митохондрий перед метаболомным анализом позволяет повысить чувствительность и обнаружить сдвиги в митохондриальных метаболитах.

Для начала эксперимента нагрейте ингредиенты корма для мушек на плитке при 90 °C. Регулярно перемешивайте смесь до достижения однородности и небольшой плотности. Снимите корм с источника нагрева и периодически перемешивайте его по мере охлаждения до 80 °C, затем добавьте 0,2% TE децепт метил-4-гидроксибензоат, растворенный в 95% Ethanol; далее разделите корм на два равных объема.

Убедитесь, что температура корма снизилась до 50 °C, и вмешайте 1,1 мл 50 мМ рапамицина, растворенного в этаноле, в первый объем и 1,1 мл необработанного этанола во второй объем. Для сбора взрослых особей используйте одноступенчатый регулятор для подачи чистого углекислого газа из баллона высокого давления. При постоянном потоке 5 PS я предотвращаю возникновение статического электричества, используя пластиковую трубку для подачи углекислого газа в фильтровальную колбу объемом 500 мл с трубкой для барботирования углекислого газа через воду.

Для этого используйте резиновую пробку с одним отверстием, чтобы герметизировать колбу. Подсоедините пластиковую трубку от бокового отверстия колбы к подушке с диоксидом углерода, чтобы контролировать плотность личинок в процессе развития. Поместите 25 пар родителей в культивационную бутыль и оставьте их для откладки яиц на 48 часов.

Затем удалите родительских особей для регулирования плотности яиц и повторите эти шаги, используя вылупившееся потомство F1, чтобы обеспечить два поколения такого контроля плотности. После двух поколений в условиях контролируемой плотности разделите мух по полу, поместив их на подложку не более чем на 10–15 минут. Дайте мухам восстановиться после анестезии в течение 24 часов, прежде чем помещать их в экспериментальные условия.

Отберите по 300 мух на образец, чтобы получить достаточное количество метаболитов для фракций, обогащенных митохондриями. Перенесите 150 мух в самодельную клетку объемом один литр. Затем перенесите оставшиеся 150 мух в отдельную клетку объемом один литр; не допускайте перенаселения клеток более чем 150 мухами.

Используйте шесть повторностей образцов для каждого экспериментального условия; для завершения разведения дрозофил поместите клетки при температуре 25 °C в условия 12-часового цикла свет/темнота. Каждые два или три дня обеспечивайте мух свежим кормом, помещая в пробирку 5 mL корма для поддержания его качества в течение всего 10-дневного периода. Начните изоляцию, перенеся мух из одной клетки в стеклянный гомогенизатор с тефлоновым пестиком, заполненный 1 mL охлажденного изоляционного буфера.

Затем поместите ступку на лед, чтобы сохранить целостность митохондрий, и гомогенизируйте мух, совершив 15 движений пестиком. Осторожно, не вращая пестик, перенесите гомогенат в пробирку объемом 1,5 мл и центрифугируйте ее при 300 ×g в течение пяти минут при температуре 4 °C. Перенесите супернатант в другую пробирку и центрифугируйте его при 6 000 ×g в течение 10 минут при температуре 4 °C для обогащения фракции митохондрий.

После центрифугирования удалите супернатант, содержащий цитозольную фракцию. Ресуспендируйте осадок в 300 µL промывочного буфера, используя метод пипетирования.

Затем объедините ресуспендированные осадки из обеих клеток в криогенной микроцентрифужной пробирке и центрифугируйте объединенные осадки при 6 000 ×g в течение 10 минут при температуре 4 °C. Удалите супернатант и подвергните осадок шоковой заморозке в жидком азоте. В завершение храните обогащенные митохондриальные фракции при температуре −80 °C.

На данном вестерн-блоте показано обогащение белком транспортных мембран митохондрий poin, который служит индикатором эффективного выделения митохондрий в митохондриальных фракциях. Белок Poin не обнаруживается в цитозольных фракциях, в то время как белок тубулин, цитозольный микротрубочковый белок, не обнаруживается в митохондриальной фракции, что свидетельствует о минимальном загрязнении цитозольными белками. Анализ главных компонентов (PCA) был проведен с использованием данных масс-спектрометрического анализа, которые были нормализованы по концентрации белка по методу Брэдфорда, логарифмически преобразованы и импутированы с использованием минимальных наблюдаемых значений для каждого соединения.

Графики PCA были построены с использованием полных метаболомных профилей нативных и мутантных штаммов мух. Метаболиты митохондриальной ДНК, полученные с помощью стандартной экстракции целой мухи, сравнивались с помощью PCA. На графике PCA метаболитов из обогащенных митохондриями экстрактов метаболомные профили разделяются вдоль оси PC2 и отражают основные эффекты воздействия рапамицина. Между альтернативными генотипами M-T-D-N-A наблюдаются лишь незначительные различия.

Напротив, метаболомные профили экстрактов, обогащенных митохондриями, демонстрируют разделение между нативным генотипом M mt DNA при обычном кормлении и тремя другими образцами: нативным MTD NA на рапамицине, а также альтернативным MTD NA как при обычном кормлении, так и при воздействии рапамицина. Это подразумевает, что эффект альтернативного MTD NA смещает метаболомные профили аналогично действию рапамицина. При выполнении данного протокола рекомендуется проводить все этапы выделения в один день, чтобы снизить вариабельность между повторностями.

Я рекомендую заранее подготовить план и промаркировать пробирки, а также вести учет интервалов ожидания между повторами для повышения качества подготовки наших образцов.