Фотоактивированные Локализация микроскопия с Бимолекулярные флуоресценции комплементации (BiFC-PALM)

Общая цель этого метода микроскопии — визуализировать белки и белковые взаимодействия в масштабе одной молекулы и нанометров. Таким образом, этот метод может помочь нам ответить на некоторые ключевые вопросы в области биологии, такие как молекулярные взаимодействия в онкогенных сигнальных процессах. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она чувствительна, специфична и предлагает разрешение в одну молекулу и нанометр.

Демонстрировать процедуру будет доктор Тахан, старший научный сотрудник моей лаборатории: После клонирования RA и RAF R-B-D-P-A-M Cherry один фрагментирует упаковку на вирусные частицы и заражает клетки U2 OS в соответствии с текстовым протоколом. Для подготовки образца для визуализации планшетом примерно в 5,5 раз по 10 до четвертой стабильной экспрессии клеток на лунку из восьми лунок стеклянной нижней камеры влейте 350 микролитров фенола красного свободного DMEM. Используйте свежий паральдегид с глутаральдегидом для фиксации клеток и после замены фиксатора на PBS или буфер для визуализации вихря 100 нанометровых частиц золота и добавьте 35 микролитров на лунку для отслеживания дрейфа ступени во время визуализации.

Подойдите к микроскопу и включите лазеры 405 и 561 нанометров, удерживая затворы закрытыми в этой точке, убедитесь, что дихроичное зеркало 561 наном и режекторный фильтр находятся на месте. Откройте программу для получения изображений. Включите фотокамеру E-M-C-C-D и дайте ей остыть, установите время экспозиции на 100 миллисекунд, а усиление E-M-C-C-D на соответствующее значение.

Добавьте иммерсионное масло в объектив и закрепите образец на столешнице микроскопа. Затем с помощью светлого поля или 561-нанометрового лазера сфокусируйте образец для визуализации РА и других мембранных белков. Используйте объектив с 60-кратным увеличением APO и числовой апертурой 1,49 и установите микроскоп в конфигурацию газона.

Отрегулируйте возбуждающий лазер таким образом, чтобы он был смещен от центра при попадании в заднюю апертуру объектива газона, что приведет к отклонению лазера при достижении буфера защитного скольжения в лицо. Продолжайте регулировать положение падения лазера до тех пор, пока не будет достигнут критический угол и лазер не отразится обратно. Найдите ячейку для изображения с несколькими золотыми частицами в поле зрения.

Затем установите интересующую область, которая заключает в себе клетку или ее область и частицы золота в случае, если достаточная активация уже происходит из-за высокого уровня экспрессии. Начните сбор данных с выключенным лазером 405 нанометра и включенным лазером 561. В противном случае включите 405-нанометровый лазер на самой низкой заводской мощности и постепенно увеличивайте ее, пока в кадре не будет десятки молекул или около того, чтобы отдельные молекулы были хорошо разделены.

По мере продолжения сбора данных постепенно увеличивайте мощность лазера на 405 нанометров, чтобы плотность пятна оставалась примерно постоянной. Продолжайте получение изображения до максимума 4 0 5. Питание больше не инициирует.

События активации завершаются для обработки изображений. Загрузите программное обеспечение для обработки изображений. Откройте MATLAB и загрузите программное обеспечение для чтения WFI.

Просмотрите последовательность необработанных изображений и определите интересующую область или ROI, выберите область стека для обработки, щелкнув левой кнопкой мыши и перетащив рамку вокруг нужной области. Если интересующая область не была уменьшена во время съемки, выберите меньшую область, чтобы сократить время вычисления для отмены выбора области и обработки всего кадра Щелкните правой кнопкой мыши в любом месте изображения рядом с ним, чтобы определить набор фидуциарных маркеров, таких как наночастицы золота, поглощенные на покровном листе, которые хорошо изолированы, однородны и имеют форму и присутствуют в поле зрения по всему стеку изображений. Начните с выбора кандидата на золотую частицу, щелкнув левой кнопкой мыши по ее изображению и перетащив вокруг нее маленькую рамку.

В разделе «Отслеживание частиц» нажмите кнопку «Отслеживать». Появится график, показывающий положение выбранной золотой частицы в стеке изображений, показывающих степень дрейфа. Повторите этот процесс, чтобы отслеживать как можно больше частиц золота и определить частицы, которые следуют вместе. Идеально.

Общий дрейф составляет не более 0,1 пикселя, по одному за раз. Выберите частицы золота, которые отслеживались вместе, и в разделе Отслеживание частиц. Нажмите кнопку добавления маркера.

Появится зеленый крестик, означающий, что частица была добавлена в качестве маркера и будет использоваться для коррекции дрейфа. При необходимости отрегулируйте диапазон сигма, диапазон сглаживания и порог, немного изменив значение. Нажмите кнопку «Найти частицы», чтобы проверить настройки и визуально осмотреть технологические частицы, такие как молекулы вишни PAM, которые относительно круглые и яркие, будут упакованы, а те, которые не являются таковыми, будут исключены.

Чтобы начать обработку изображений, нажмите кнопку «Создать файл шнура» и сохраните файл под нужным именем для последующей обработки изображений и рендеринга изображения ладони. Запустите пакет palm в MATLAB, загрузите только что созданный файл dot core. Предварительно отрисованное изображение появится в поле изображения рядом с кнопками управления.

Отсортируйте отдельные координаты, используя следующие типичные значения. Для PAM Cherry one объединение кадров равно восьми. Суммарное расстояние в нанометрах равно 100, минимальное среднеквадратичное значение равно четырем.

Минимальное прилегание равно 0,25, а максимальный эксцентриситет равен 1,4. Нажмите кнопку сортировки, чтобы создать новый набор курированных координат, готовых к рендерингу изображений с высоким разрешением. Введите значения для правильной визуализации конечного изображения, такие как размер исходного пикселя, как определено ранее, желаемый размер элемента в визуализированном изображении, который обычно устанавливается на значение, немного превышающее среднюю локализацию, и размер пикселя, например 10 нанометров.

Для визуализированного изображения нажмите кнопку рендеринга, чтобы создать изображение ладони. Затем используйте значки увеличения «плюс» и «минус» на панели инструментов окна рисунка, чтобы увеличивать и уменьшать масштаб для отслеживания отдельных молекул в живых клетках. Обработайте поверхность тканевой культуры и нанесите на клетки пластины, как описано ранее в этом видео.

Убедитесь, что покровное стекло имеет подходящую толщину для микроскопии, настроенной после пересечения клеток и выполнения любых обработок и инкубации, необходимых для эксперимента, поместите чашку для культивирования в инкубатор на сцене. Дайте блюду осесть на сцене в течение нескольких минут, пока температура и концентрация CO2 не стабилизируются на этом этапе. Заблокируйте лазеры.

Если контроль CO2 недоступен, переключитесь на независимую от CO2 среду непосредственно перед получением изображения, такую как L 15 Лейбовица, чтобы подавить фоновую флуоресценцию, и в конечном итоге получите изображения, как было показано ранее, установив соответствующее время экспозиции, чтобы обеспечить хорошее соотношение сигнал/шум без потери временного разрешения. Пальма BFC на этом рисунке — это мутант KRAS G 12 D, взаимодействующий с связывающим доменом RAs или RBD CRAF. Каждая из четырех показанных здесь комбинаций была введена в клетки U2 OS с использованием лентивирусной инфекции: две из этих конфигураций имели сильные положительные сигналы BFC, что было идентифицировано по резкому увеличению флуоресценции при включении 405-нанометрового лазера из-за фотоактивации восстановленного BFC PAM Cherry one, как показано здесь с использованием тех же экспериментальных настроек, что и с родительским PAM Cherry one.

Сильный сигнал BFC генерировался после заражения RN R и RAF RBD RC. Здесь RN и RC обозначают n и C концевой фрагмент PAM Cherry one соответственно при увеличении отдельных молекул, и их наноразмерное пространственное распределение можно ясно увидеть в этом эксперименте, где было выполнено отслеживание одной молекулы ладонью для получения диффузионных траекторий отдельных RA. Комплексы RAF RBD при непрерывном освещении лазерами 561 нм и 405 нм. Индивидуальная ПА м вишня одна молекула ст.

Включите и продержитесь несколько кадров, прежде чем войти в темные состояния, где они были обнаружены либо неподвижными, либо мобильными. Этот график записей для нескольких молекул ясно иллюстрирует оба типа траекторий. Такое же гетерогенное распределение состояний диффузии можно вывести из гистограммы смещения молекул между последовательными кадрами Mass mastered.

Эта техника может быть выполнена за одну-три недели, в зависимости от того, трансцендентно ли конструкции, трансфицированы или стабильно угнетены, если она выполнена правильно. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о подготовке элементов управления, таких как мутантные Путины, которым не хватает взаимодействия после этой процедуры. Другие методы, такие как кластерный анализ, могут быть выполнены, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, как пространственно организованы белковые взаимодействия в клетке?

Для отслеживания лабораторных клеток может быть выполнена оценочная база, отслеживание отдельных частиц для определения состояний диффузии и вероятностей перехода после ее разработки. Этот метод используется в нашей лаборатории в области биологии рака для изучения взаимодействий влечений РА, а также гомосексуализма и его семейных рецепторов в опухолевых клетках человека. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как разработать и внедрить биопсию ладони для исследования интересующего вас взаимодействия белков.

Не забывайте, что работа с антивирусом и опухолевыми клетками может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как стандартные протоколы биологической безопасности.