Использование конфокальной Анализ

Общая цель данной методики заключается в визуализации секреции и диффузии лигандов с флуоресцентной меткой в неповрежденном эпителии с использованием экспрессии в xip pos lavis. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы об установлении морфогенных градиентов, которые, как известно, играют важную роль в спецификации клеточных линий в ходе раннего эмбрионального развития. Основным преимуществом данной техники является то, что она представляет собой простой способ визуализации распределения лигандов в неповрежденном эпителии.

Важной частью протокола является получение биологически активных лигандов, которые подвергаются нормальному процессингу и секреции и способны вызывать ответ в клетках-реципиентах, несмотря на наличие прикрепленной флуоресцентной метки. Конфокальная микроскопия является идеальным способом изучения локализации флуоресцентно меченных белков в трехмерных тканях; использование независимых лазеров и детекторов позволяет проводить точный анализ в таких сложных типах тканей и собирать надежные данные. После синтеза мРНК, кодирующей флуоресцентно меченные лиганды, и получения эмбрионов XUS lavis согласно письменному протоколу, введите мРНК вместе с маркером клеточной линии, таким как мембранный RFP, в одну клетку на стадии 16–32 клеток; при необходимости вместе с флуоресцентным лигандом и маркером линии можно ввести модулятор для анализа его эффектов.

Иногда бывает полезно ввести вещества также в соседнюю клетку. В данном случае вторая клетка инъецируется рядом с ранее введенной клеткой. В одну клетку вводят мРНК, кодирующие лиганд с меткой GFP и маркер клеточной линии, такой как мембранный RFP, в то время как в другую клетку вводят мРНК, кодирующие модулятор и другой маркер клеточной линии, такой как мембранный cerulean; эмбрионы переносят в инкубатор при температуре 12.5 °C и культивируют до достижения новой стадии. На восьмой стадии по Фабер, на следующий день, когда эмбрионы достигнут восьмой стадии, заполняют чашки, покрытые 1% агарозой, раствором NAM 2 и переносят эмбрионы с помощью стеклянной пипетки с обрезанным концом, используя вольфрамовые иглы.

Вырежьте круговые эксплантаты из живочного полюса инъецированных и контрольных эмбрионов, стараясь не захватить мезодерму. Перенесите эксплантаты животных в чашки Петри диаметром 55 мм, покрытые 1% агарозой, и культивируйте эмбрионы в течение четырех часов, чтобы дать флуоресцентным белкам созреть для создания рельефа. Для подготовки предметных стекол нанесите два слоя изоляционной ленты ПВХ на микроскопные стекла, полностью прижав их.

Вырежьте из ленты прямоугольник размером 14 на 10 миллиметров для крепления крышек с животными. Затем с помощью пипетки нанесите две отдельные капли NM 2 на предметное стекло с углублением. После этого, используя обрезанный наконечник P 20, перенесите до 15 эксплантов животных на каждое стекло и с помощью пинцета ориентируйте экспланты X так, чтобы апикальная сторона была направлена вверх.

С помощью алмазного резца сделайте надрез на стеклянном покровном стекле и разломите его, чтобы получить стекло меньшего размера. Чтобы установить его на рельефный предметный препарат, осторожно опустите покровное стекло на рельефный предметный препарат с помощью изогнутой иглы 19 калибра. Это позволит сжать апикальный слой клеток животного полюса (animal cap).

Используйте лак для ногтей, чтобы герметизировать предметное стекло, и дайте ему высохнуть в темноте в течение 20 минут, после чего проведите визуализацию в течение четырех-шести часов. Чтобы сохранить целостность коронок животных, они должны быть правильно ориентированы в специальных предметных стеклах, а затем накрыты покровными стеклами. Аккуратно помещайте образцы на стекла.

Крайне важно не использовать слишком много лака для ногтей при герметизации предметных стекол, так как это приведет к образованию складок на ленте, что впоследствии нарушит герметичность препарата. После того как техника будет освоена, вам потребуется инжектировать около 25 эмбрионов, чтобы получить 20 качественных животно-эмбриональных «шапочек» (animal caps) для каждого интересующего вас условия. Затем их можно будет проанализировать с помощью конфокальной микроскопии на следующий день.

Для проведения визуализации используйте объектив с малым увеличением, чтобы найти X explan. Затем переключитесь на масляный объектив 63 x 1.4 для получения изображений с более высоким разрешением. Включите необходимые лазеры, включая 405 для MIAN, 488 для GFP и 561.

Для MRFP оптимизируйте мощность лазеров таким образом, чтобы можно было обнаружить все флуорофоры. Используя массив из 32 детекторов, минимизируйте необходимые значения напряжения и усиления, затем перейдите в режим Lambda и выберите лазеры с длиной волны 405 нм, 488 нм и 561 нм. Чтобы расширить поле зрения, уменьшите масштаб изображения до 0,6 x.

Затем установите размер кадра в соответствии с желаемым размером изображения. Это обеспечит достаточное разрешение для анализа; при этом установите усреднение от четырех до восьми кадров для повышения отношения сигнал/шум и оптимизируйте диафрагму (пинхол) для данного набора данных. Одна единица площади была определена с использованием лазера с длиной волны 561 нм, а также лазеров 405, 488 и 561 нм.

Дихроичные зеркала собирают свет, излучаемый мембранным Saru, GFP и мембранным RFP. В данном эксперименте свет собирали примерно каждые 10 нм в диапазоне от 415 до 720 нм. Выполните анализ изображений в соответствии с текстовым протоколом, представленным здесь; показано распределение меченого GFP sonic hedgehog в эксплантате головного отдела животного. В контрольных условиях sonic hedgehog GFP секретируется и диффундирует за пределы области экспрессии введенных мРНК.

Однако в присутствии модулятора SULF1 распределение Sonic Hedgehog GFP становится более ограниченным. В данном образце лишь несколько очагов Sonic Hedgehog GFP видны на небольшом расстоянии от клона клеток, которые его продуцируют. На этом рисунке показана характеристика двух лигандов Wnt с флуоресцентными метками, введенных в клетки, как указано здесь; оба, Wnt8A и Wnt11B-H-A-E-G-F-P, накапливаются на мембране клеток анимального полюса, при этом Wnt8A-H-A-E-G-F-P накапливается более эффективно, чем Wnt11B. На этом рисунке показано распределение Wnt8A-H-A-E-G-F-P, экспрессируемого в клоне клеток, помеченных мембранно-связанным белком Cerulean.

Видно, что флуоресцентно меченный лиганд диффундирует от клеток-источников в окружающие клетки эпителия. Для извлечения данных о распределении флуоресцентно меченных лигандов wind в нескольких экспериментальных образцах, представленных здесь, используется программное обеспечение для анализа изображений. Измеряются расстояние от клона, экспрессирующего mem Saru, и уровень флуоресценции GFP для определения радиуса диффузии wind и формы градиента.

После измерения распределения лиганда выход сигнального пути также можно оценить, объединив данный протокол с другим анализом для мониторинга ответа принимающих клеток. Таким образом можно попытаться определить пороговый диапазон морфогена.