Бактериальный искусственные хромосомы: Функциональный геномики инструмент для изучения Положительный нити РНК вирусы

Общая цель этой процедуры заключается в спасении инфекционных вирусных частиц, полностью состоящих из клонированной КДНК положительной цепи, РНК-вирусов, геномы которых находятся в той же полярности, что и клеточные Mr.NA, таких как вирус японского энцефалита. Эта регенная генетика на основе CNA представляет собой полуальный метод, который позволяет напрямую манипулировать вирусной геномной РНК, тем самым создавая рекомбинантные вирусы для молекулярного и генетического изучения в области репликации вируса и патогенеза. Этот метод также обеспечивает ценную платформу, позволяющую разрабатывать генетически определенные вакцины и вирусные векторы для доставки чужеродных генов.

Эти сосуды применимы для клонирования полноразмерных КДНК на длину или положительного штамма, РНК-вирусов, особенно с геномами более 10.н. Демонстрировать процедуру будут несколько членов моей лаборатории, научный сотрудник профессор Сан Нун, постдокторант UNG и Син и Ким, а также студенты бакалавриата Джордан Франк. Видеочасть этой публикации посвящена получению бактериальной искусственной хромосомы, содержащей интересующие последовательности, синтезу РНК, транскрибируемой из обратной плазмиды, а также способам измерения инфекционности РНК и выхода вируса.

Все процедуры, используемые перед генерированием спинной плазмиды, очень подробно описаны в текстовом протоколе. Для этой процедуры сначала выращивают одну колонию кишечной палочки DH 10 B, перенося обратно плазмиду в трех миллилитрах двух XYT бульона с левомицетином. Инкубируйте культуру в течение 10 часов при температуре 35 градусов Цельсия с встряхиванием при 225-250 об/мин.

Через 10 часов масштабируйте культуру, затем инокулируйте 500 микролитров роста в 500 миллилитров среды и обрабатывайте посевной материал в течение шести часов с энергичным встряхиванием через шесть часов. Центрифугируйте бактериальную культуру в 2 флаконах по 250 миллилитров при давлении 3 100 г в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия. Затем повторно суспендируйте каждую гранулу в 30 миллилитрах раствора ГТД.

Добавьте 500 микролитров лизоцима и выдержите суспензии на льду в течение 10 минут. Тем временем приготовьте свежий раствор для лизиса для следующего этапа. Через 10 минут добавьте 60 миллилитров лизисного раствора и перемешайте, взбалтывая, пока раствор не станет прозрачным.

Дайте реакции идти при комнатной температуре в течение 10 минут. Далее добавьте в каждую бутылку по 45 миллилитров нейтрализующего раствора и переверните флаконы до тех пор, пока они полностью не перемешаются. Затем выложите их на лед на 10 минут.

Соберите нейтрализованные лизаты с помощью охлаждаемого центрифугирования с высокой перегрузкой. Затем соберите надосадочную жидкость в два новых флакона по 250 миллилитров. Добавьте в каждый по 0,6 объема 100% изопропанола и положите их на лед на 20 минут.

Затем уменьшите количество осадков, затем выбросьте надосадочную жидкость и растворите гранулы в пяти миллилитрах TE-буфера. Объедините два объема в одной 50-миллилитровой пробирке и осаждайте РНК, добавив равный объем пяти моляров хлорида лития и инкубируя смесь на льду в течение 10 минут. Используйте 20-минутное холодное центрифугирование для сбора осадка РНК.

Затем переложите надосадочную жидкость в новую 250 миллилитровую трубку. Добавьте два объема 100% изопропанола и положите пробирку на лед, чтобы образовался осадок ДНК. Через 20 минут замедлите выпадение осадка, аспирируйте надосадочную жидкость, повторно суспендируйте гранулу ДНК в 9,5 миллилитрах TE-буфера и перенесите раствор ДНК в 50-миллилитровую пробирку.

Продолжайте приготовление, устанавливая градиент хлорида цезия с бромидом натрия. Загрузите смесь в герметичную полипропиленовую трубку с помощью шприца с иглой 18 калибра и запечатайте трубку. Вращайте герметичную пробирку в течение ночи в ультрацентрифуге, чтобы образовался градиент хлорида цезия.

На следующий день собирают полосу ДНК обратной плазмиды из градиента хлорида цезия. Используйте иглу 18 калибра для создания вентиляционного отверстия в верхней части градиента и иглу 20 калибра со шприцем для сбора задней ДНК со стороны градиента, а затем перенесите сбор в микропробирку объемом 1,7 миллилитров. Проведите промывку, добавьте 2,5 объема пропитанного водой бутанола и перемешайте с обычным вортексом.

Затем центрифугируйте смесь при комнатной температуре и перенесите нижнюю водную фазу в новую микропробирку объемом 1,7 миллилитров. Повторите эту промывку в общей сложности шесть раз, чтобы удалить весь бромид этидия. Теперь осаждайте заднюю ДНК.

Добавьте в пробирку один 10-й объем трех моляров ацетата натрия и 2,5 объема 100% этанола. Выдержать смесь на льду в течение 10 минут. Затем центрифугируйте осадок при комнатной температуре и промойте гранулу ДНК одним миллилитром 70% этанола.

Повторите вращение и снова соберите дробину. Наконец, высушите гранулированную ДНК на воздухе в течение 10 минут и поместите ее в 200 микролитров TE-буфера. Начните с широкомасштабного ферментного расщепления спинной плазмиды с xbo.

Один в общем объеме 100 микролитров. Выполняйте это пищеварение при температуре 37 градусов Цельсия в течение 12-15 часов. Затем дополнительно инкубируйте процесс пищеварения с дополнительными 25 единицами нуклеазы бобов мунг при температуре 30 градусов Цельсия в течение двух часов.

После инкубации доведите объем до 300 микролитров с помощью дистиллированной воды. Теперь проведите экстракцию фенола, добавив к разведенной пробе равный объем фенолахлороформа, изоамилового спирта. Энергично вортексую в течение минуты, раскручивая трубку вниз и перенося верхнюю водную фазу в новую трубку.

Затем повторите экстракцию хлороформом. Затем восстановите линеаризованную обратную ДНК с помощью осаждения этанола. Соберите гранулу ДНК с помощью центрифугирования, выбросьте надосадочную жидкость и промойте гранулу одним миллилитром 70% этанола.

Повторите этап центрифугирования и высушите гранулу на воздухе. После 10 минут высыхания растворите гранулу ДНК в 30 микролитрах дистиллированной воды. Затем исследуйте один микролитр восстановленного обратно на 0,8% геля AROS.

Затем настройте транскрипцию линеаризованной обратной ДНК объемом 25 микролитров, включая тритированный UTP для количественного определения РНК. Проводите реакцию при температуре 37 градусов Цельсия в течение часа. Затем исследуйте один или два микролитра реакции транскрипции стока на геле 0,6% AROS.

Начните с BHK 21 клетки, выращенной в течение 24 часов в 150-миллиметровых чашках с 3 миллионами клеток на чашку. Промойте монослои клеток холодным раствором А, а затем отделите их трипсином. Изация. Соберите ячейки центрифугированием при давлении 270 GS в течение двух минут.

Затем ресуспендируйте клетки в 50 миллилитрах холодного раствора А и снова раскрутите их. Повторите эту стирку три раза после последней стирки. Ресуспендируйте клетки при концентрации 20 миллионов на миллилитр в растворе А. Затем смешайте 400 микролитров клеточной суспензии с двумя микрограммами синтетической РНК в двухмиллиметровом весе.

Немедленно проведите электроочистку смеси в оптимальных условиях и дайте клеткам отдохнуть в течение 10 минут. Затем перенесите клетки в микропробирку, содержащую 600 микролитров полной питательной среды. Теперь приготовьте десятикратное серийное разведение электропорированных клеток в одном миллилитре объемной пластины 100 микролитров каждого разведения на монослоях нормальных клеток bhk 21 после четырех-шести часов инкубации, наложите на клетки 0,5% aros в MEM плюс FBS и культивируйте их еще четыре дня.

Клетки Bhk 21 были искусственно электропорированы или электропорированы с помощью РНК-транскриптов, полученных из двух независимых клонов полной длины JEV. Четыре дня спустя клетки окрашивали кристаллическим фиолетовым цветом для просмотра инфекционной РНК в клетках. С помощью этого окрашивания были количественно определены инфекционные центры. Следующая экспрессия вирусного белка была исследована в электропорированных клетках РНК через 20 часов после трансфекции с использованием анти-NS, одной сыворотки против кролика и трех конъюгированных вторичных антител SI, выделенных красным цветом.

Ядра были покрыты противовесом, DAPI был виден синим цветом. В дальнейшем, через 22 и 40 часов после трансфекции, в культуре накапливались инфекционные варианы. Супернатанты РНК-электропорированных клеток исследовали с помощью бляшек.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как полностью спасти инфекционный вирус из клонированного CNA положительного штамма РНК, такого как вирус японского энцефалита. Так что не забывайте, что работа с вирусом японского энцефалита и другими патогенами человека может быть крайне опасной. Перед выполнением этой процедуры необходимо пройти надлежащую подготовку по биобезопасности.