Быстрый

Общая цель данной процедуры заключается в проведении экспресс-гибридизации in situ на фиксированной параформальдегидом ткани мозга. Это достигается путем предварительного обезвоживания срезов ткани мозга и обработки их реагентами для предварительной обработки один, два и три. На втором этапе срезы гибридизируют с первичными олигонуклеотидными зондами, а затем со вторыми, третьими и четвертыми зондами.

Затем добавьте субстрат Fast Red для обнаружения целевой РНК. Заключительным этапом является количественная оценка уровней сигналов мРНК с помощью программного обеспечения Image J. В конечном итоге можно определить изменения в экспрессии генов РНК путем сравнения экспериментальной и контрольной групп.

Основным преимуществом данной методики по сравнению с существующими методами является то, что она относительно проста, недорога, воспроизводима и занимает менее двух дней. Эта работа была разработана мной, Джоном Джеем Ленаном из Школы ветеринарной медицины Университета Росс, а также Жаном Созой и РУ Тао из Медицинского колледжа Университета Флорида Атлантик. В данной процедуре, для дегидратации, возьмите четыре предметных стекла из контейнеров для микроскопии, хранящихся в морозильнике при температуре -80 °C.

Разделите срезы на группы для тестов P-P-I-B-D-A-P-B и HT two A genes, промаркируйте и подпишите их шариковой ручкой. Затем погрузите стекла в 100% спирт при комнатной температуре на пять минут. После этого высушите стекла в вытяжном шкафу в течение пяти минут. Для предварительной обработки внесите пипеткой 20 µL реагента для предобработки один на каждый срез, затем поместите стекла на направляющую стойку в увлажняющий лоток.

Осторожно встряхивайте лоток с образцами на горизонтальном шейкере на низкой скорости в течение 10 минут. Затем дважды промойте предметные стекла дважды дистиллированной водой по две минуты. Погрузите предметные стекла в стакан объемом 1000 мл, содержащий 450 мл реагента для предварительной обработки № 2.

Затем кипятите предметные стекла в общей сложности пять минут при 100 °C для восстановления структуры РНК. После этого дважды промойте стекла дважды дистиллированной водой, по две минуты каждый раз. Поместите предметные стекла в 100% спирт на пять минут.

Затем высушите предметные стекла в течение пяти минут. В вытяжном шкафу с помощью гидрофобного маркера обведите выбранную область в срезе ткани. После этого нанесите пипеткой по 10 µL реагента для предварительной обработки №3 на каждую выбранную область для усиления проникновения зонда и накройте увлажняющий лоток крышкой.

Затем поместите лоток в гибридизационный oven, оснащенный горизонтальным шейкером. Установите температуру в oven на 40 °C и осторожно встряхивайте лоток в течение 30 минут. После этого дважды промойте предметные стекла дважды дистиллированной водой по две минуты каждый раз. На этом этапе нанесите пипеткой 10 µL зонда P-P-I-B-D-A-P-B или HTR two A на выбранные области.

Затем накройте увлажняющий лоток крышкой, чтобы предотвратить испарение реагента. Осторожно встряхивайте предметные стекла на горизонтальном шейкере на низкой скорости, инкубируя их в печи при 40 °C в течение двух часов. Затем дважды промойте предметные стекла промывочным буфером по две минуты каждый раз, после чего нанесите пипеткой 10 µL реагента для амплификации 1 на каждую выбранную область.

Встряхните предметные стекла и инкубируйте их при 40 °C в течение 30 минут. Затем промойте стекла дважды промывочным буфером по две минуты за каждый раз, после чего нанесите пипеткой 10 µL реагента для амплификации 2 на каждую выбранную область. Встряхните и инкубируйте стекла при 40 °C в течение 15 минут.

После этого дважды промойте предметные стекла промывочным буфером в течение двух минут. Каждый раз наносите пипеткой 10 µL реагента для амплификации 3 на каждую выбранную область. Встряхните и инкубируйте предметные стекла при 40 °C в течение 30 минут.

Затем дважды промойте предметные стекла промывочным буфером в течение двух минут. Пипеткой нанесите 10 µL реагента для амплификации 4 на каждую выбранную область. Встряхните и инкубируйте предметные стекла при 40 °C в течение 15 минут.

Затем дважды промойте предметные стекла промывочным буфером в течение двух минут. Нанесите по 10 µL реагента для амплификации 5 на каждую выбранную область. Встряхните и инкубируйте предметные стекла при комнатной температуре в течение 30 минут.

Затем дважды промойте предметные стекла промывочным буфером в течение двух минут. Нанесите пипеткой 10 µL реагента для амплификации шесть на каждую выбранную область. Перемешайте и инкубируйте предметные стекла при комнатной температуре в течение 15 минут.

Затем снова дважды промойте предметные стекла промывочным буфером по две минуты каждый раз. Теперь внесите пипеткой 10 µL красного реагента на каждую выбранную область, поместите предметные стекла в увлажняющий лоток на горизонтальный шейкер при комнатной температуре и осторожно встряхивайте на низкой скорости в течение 10 минут. После этого промойте предметные стекла дважды дважды дистиллированной водой дважды перегнанной в течение 10 минут.

Каждый раз высушивайте стекла в печи при 60 °C в течение 15 минут. После этого поместите стекла в ксилол в вытяжном шкафу на пять минут. Затем нанесите пипеткой по 20 µL смолы для заключения на ксилоле на каждую выбранную область и накройте покровным стеклом.

На этом этапе перетащите файл изображения в основное окно ImageJ. В строке меню выберите пункт Image. Затем в выпадающем меню выберите Type и установите значение 8-bit.

Затем выберите Adjust, а затем Threshold, чтобы открыть диалоговое окно. Отрегулируйте значение нижнего ползунка в диалоговом окне так, чтобы удалить ненужный фон. В строке меню выберите Analyze, затем Analyze Particles, чтобы открыть второе диалоговое окно.

Установите размер частиц на 10. Затем выберите «показать контуры» (show outlines), а также «отобразить результаты» (display results) и «сводные таблицы» (summarize boxes). Наконец, нажмите «ОК», чтобы просмотреть данные о частицах в диалоговых окнах.

Для расчета в электронной таблице введите данные в лист Excel и вычислите среднее количество частиц в группе с физиологическим раствором в качестве базовой линии. Затем рассчитайте процентный уровень для каждого раздела и постройте соответствующий график. Ниже представлены изображения сигналов гибридизации при световой микроскопии, отмеченных красными точками.

Ткани глубоко анестезированных крыс, ранее получавших физиологический раствор и MDMA, фиксировали параформальдегидом. Использовались олигонуклеотидные зонды D-A-P-B-P-P-I-B и HT two A. На данном рисунке показано влияние на экспрессию гена HT two A в гипоталамусе у крыс, ранее получавших MDMA; наблюдалось снижение экспрессии HT two A на 20%. Этот метод позволяет исследователям в области нейробиологии измерять экспрессию мРНК с помощью гибридизации in situ в параформальдегид-фиксированной ткани мозга.