Быстрый На месте Гибридизация с использованием олигонуклеотидных зондов на ПАРАФОРМАЛЬДЕГИДОМ префиксом мозге крыс с синдромом серотонина

Общая цель этой процедуры заключается в проведении быстрой гибридизации in C two на ткани мозга с префиксом параформы альдегида. Это достигается путем предварительного обезвоживания участков мозговой ткани и обработки срезов одним, двумя и тремя реагентами для предварительной обработки. Второй шаг заключается в гибридизации участков с первичными олигонуклеотидными зондами, а затем со вторым, третьим и четвертым зондами.

Затем добавьте быстрый красный субстрат для обнаружения целевой РНК. Последним шагом является количественная оценка уровня сигналов мРНК с помощью программного обеспечения Image J. В конечном счете, изменения в экспрессии генов РНК могут быть получены путем сравнения экспериментальной и контрольной групп.

Основное преимущество этой методики перед существующими методами заключается в том, что она относительно проста, недорога в воспроизведении и занимает менее двух дней. Эта работа была разработана мной и Джоном Джеем Ленаном из Школы ветеринарной медицины Университета Росса, а также Джином Созой и Ру Тао из Медицинского колледжа Атлантического университета Флориды. В этой процедуре для ее обезвоживания берут четыре предметных стекла из предметных коробок микроскопа, хранящихся в морозильной камере с отрицательными температурами 80 градусов по Цельсию.

Назначьте срезы на тесты P-P-I-B-D-A-P-B и HT с двумя пометками А гена и пометьте их шариковой ручкой. Далее погрузите горки в 100% спирт при комнатной температуре на пять минут. Затем просушите предметные стекла в течение пяти минут в вытяжном шкафу для предварительной обработки пипеткой по 20 микролитров предварительной обработки по одному реагенту на каждую секцию, поместите предметные стекла на стеллажную рейку в лоток для влаги.

Аккуратно встряхните лоток с влагой на горизонтальном встряхивателе на низкой скорости в течение 10 минут. Затем дважды промойте горки дважды дистиллированной водой в течение двух минут. Погрузите предметные стекла в стакан объемом 1000 миллилитров, содержащий 450 миллилитров реагента для предварительной обработки двух веществ.

Затем прокипятите предметные стекла в общей сложности пять минут при температуре 100 градусов Цельсия, чтобы восстановить структуру РНК. После этого каждый раз дважды промойте предметные стекла дважды дистиллированной водой в течение двух минут. Поместите предметные стекла в 100% спирт на пять минут.

Затем просушите горки в течение пяти минут. В вытяжном шкафу с помощью гидрофобной ручки нарисуйте круг вокруг выбранной области на участке ткани. Впоследствии пипеткой по 10 микролитров предварительно обработанных трех реагентов на каждый выбранный участок для увеличения проникновения щупа и накрываем лоток для влаги крышкой.

Далее поместите противень в печь для гибридизации, оснащенную горизонтальным встряхивателем. Установите температуру духовки на 40 градусов Цельсия и осторожно встряхивайте противень в течение 30 минут После этого дважды промойте горки двойной дистиллированной водой в течение двух минут каждый раз. На этом этапе пипеткой нанесите 10 микролитров P-P-I-B-D-A-P-B или HTR два А зонда на выбранные участки.

Затем накройте лоток для влаги крышкой, чтобы предотвратить испарение реагента. Аккуратно встряхивайте слайды на горизонтальном шейкере на низкой скорости, выдерживая их при температуре 40 градусов Цельсия в духовке в течение двух часов. Далее дважды промойте предметные стекла промывочным буфером в течение двух минут каждый раз, внесите пипеткой по 10 микролитров усилительного одного реагента на каждый выбранный участок.

Встряхните и выдержите предметные стекла при температуре 40 градусов Цельсия в течение 30 минут. Затем дважды промойте предметные стекла промывочным буфером в течение двух минут каждый раз, пипеткой нанесите по 10 микролитров усилительного двух реагентов на каждый выбранный участок. Встряхните и выдержите предметные стекла при температуре 40 градусов Цельсия в течение 15 минут.

После этого дважды промойте предметные стекла с буфером для стирки в течение двух минут. Каждый раз пипеткой по 10 микролитров амплификатора тремя реактивами на каждую выбранную область. Встряхните и выдержите предметные стекла при температуре 40 градусов Цельсия в течение 30 минут.

Затем дважды промойте предметные стекла промывочным буфером в течение двух минут. Пипеткой нанесите по 10 микролитров амплификатора четырьмя реактивами на каждую выбранную зону. Встряхните и выдержите предметные стекла при температуре 40 градусов Цельсия в течение 15 минут.

Далее дважды промойте слайды с буфером для промывки в течение двух минут. Пипетируйте по 10 микролитров амплификацией пять реактивов на каждый выбранный участок. Встряхните и выдержите горки при комнатной температуре в течение 30 минут.

Впоследствии дважды промойте горки с буфером для промывки в течение двух минут. Пипетируйте по 10 микролитров усилительной шестеркой реактива на каждый выбранный участок. Встряхните и выдержите предметные стекла при комнатной температуре в течение 15 минут.

Затем снова дважды промойте слайды с буфером для промывки каждый раз в течение двух минут. Теперь нанесите пипеткой по 10 микролитров красного реактива на каждый выбранный участок, поместите предметные стекла в лоток для влаги на горизонтальном шейкере при комнатной температуре и осторожно встряхните на низкой скорости в течение 10 минут. Затем дважды промойте горки двойной дистиллированной водой в течение 10 минут.

Каждый раз сушите горки при температуре 60 градусов Цельсия в духовке в течение 15 минут. После этого поместите предметные стекла в ксилол в вытяжной шкаф на пять минут. Далее нанесите пипеткой 20 микролитров монтажного носителя на основе ксилола на каждую выбранную область и накройте крышкой.

На этом шаге перетащите файл изображения в главное окно изображения J. Перейдите в строку меню и выберите изображение. Затем выберите тип из выпадающего меню и выберите восемь бит.

Затем выберите «Настроить», затем выберите порог, чтобы открыть диалоговое окно. Отрегулируйте нижнее значение полосы в диалоговом окне так, чтобы нежелательный фон был удален. Перейдите в строку меню и выберите «Анализировать», затем выберите «Анализировать частицы», чтобы открыть второе диалоговое окно.

Установите размер частиц на 10. Затем выберите Показать контуры и выберите отображение результатов и поля суммирования. Наконец, нажмите OK, чтобы просмотреть данные о частицах в диалоговых окнах.

Для вычисления в таблице введите данные на лист Excel и усредните количество частиц в группе соли в качестве базового уровня. Затем рассчитайте процентный уровень каждого участка и составьте соответствующий график. Вот светлые микроскопические изображения сигналов гибридизации, обозначенных красными точками.

Ткани предваряли параформным альдегидом у крыс с глубокой анестезией, ранее получавших физиологический раствор и МДМА. В качестве олигонуклеотидных зондов используются D-A-P-B-P-P-I-B и HT два A. На этом рисунке показано влияние на экспрессию гена HT two A в гипоталамусе у крыс, ранее получавших MDMA, и наблюдалось снижение экспрессии HT two на 20%. Этот метод облегчает исследователям в области нейробиологии измерение экспрессии гена messenger Ra, используя in situization on paraform, префикс высоты мозговой ткани.