Оптический Картирование Intra-саркоплазматического ретикулума Са ²⁺ И трансмембранный потенциал в Лангендорфа-перфузии сердца кролика

Общей целью этой процедуры является одновременное оптическое картирование свободного внутрисаркоплазматического ретикулума, кальция и трансмембранного потенциала в интактном изолированном сердце кролика, перфузируемом ЛОР. Это достигается путем предварительного иссечения кроличьего сердца и канюлирования аорты для ретроградной ланорной перфузии. Второй шаг заключается в устранении сокращения путем добавления возбуждающего сокращения к восьмерке.

Затем перфузия переключается на рециркуляционный контур малого объема и добавляется показатель кальция с низким сродством при комнатной температуре. Заключительные шаги заключаются в том, чтобы нагреть сердце до 37 градусов Цельсия с помощью петли большого объема и добавить чувствительный к напряжению краситель. Таким образом, в ходе эксперимента измеряются изменения кальция и трансмембранного потенциала путем возбуждения сердца синим светом и измерения излучаемого света с помощью высокоскоростных камер CM OS.

Основное преимущество этой методики перед существующими методами заключается в том, что она позволяет исследователям напрямую зондировать саркоплазматический ретикулум или SR на предмет короткой динамики кальция без помех со стороны трансмембранных кальциевых сигналов. Этот метод также может помочь ответить на ключевые вопросы, связанные с ролью обработки SR-кальция в развитии аритмий, поскольку трансмембранный потенциал регистрируется одновременно с SR-кальцием. Поэтому правильная загрузка показателя кальция имеет важное значение Для этого протокола необходимо иметь под рукой свежеприготовленный раствор тиро.

Четырех литров будет достаточно. Не смешивайте концентрированные исходные растворы без разбавления. Кроме того, заранее подготовьте другие растворы, как указано в текстовом протоколе, сведите подачу в тирос 95% кислорода и 5% углекислого газа и отрегулируйте поток газа так, чтобы pH раствора был очень близок к 7,4.

Раствор должен быть комнатной температуры. Подготовьте рециркуляционную перфузионную систему Landorf, поместив встроенный нейлоновый фильтр с порами 11 микрон для фильтрации перфузионного фильтра. Теперь заправьте основную систему изобилия примерно двумя литрами насыщенного кислородом тайроса.

В двухлитровый общий объем входит раствор в резервуаре. Затем подготовьте и загрунтуйте короткую линию изобилия, которая обходит резервуар с раствором, чтобы создать небольшую объемную рециркуляционную петлю изобилия для гриппа в пять часов утра. При загрузке общий объем в меньшую систему рециркуляции должен составлять около 150 миллилитров.

Чтобы подготовить систему контроля давления, подключите датчик давления к линии Profusion и подключите выход датчика к трансмостовому усилителю. Теперь включите систему сбора данных. Настройте его на непрерывный контроль ЭКГ и давления обильности.

Далее отрегулируйте базовое перфузионное давление до нуля миллиметров ртутного столба. Наконец, выровняйте оптическую картографическую камеру, как описано в текстовом протоколе. Для начала обезопасьте кролика и обезболите его пентобарбиталом, вместе с болюсом 1000 единиц гепарина.

Закройте глаза, чтобы успокоить кролика. Начните с разреза по средней линии, чтобы обнажить грудину и ребра с помощью ножниц с тупым кончиком. Разрежьте грудину между мечевидным и мейбумом.

Далее осторожно вскройте грудину, не повредив сердце, и раздвиньте ребра, чтобы обнажить сердце. Затем быстро удалите весь сердечный блок легких, вырезав все окружающие сосуды и ткани. Перенесите блокаду легких сердца примерно в 100 миллилитров ледяного раствора.

В блоке иссеченной ткани найдите аорту и разрежьте восходящую аорту проксимальнее трех ветвей дуги аорты. Затем канюлируйте аорту с помощью канюли восьмого калибра, прикрепленной к системе Produsion. Закрепите аорту на канюле куском шелкового шовного материала USP.

Закрепив канюлю, тщательно удалите трахею, легкие и эпикардиальный жир. Далее определите митральный клапан и осторожно с помощью острых щипцов и ножниц повредите или удалите одну створку. Таким образом, застой раствора в левом желудочке происходить не может.

Продолжайте, погружая сердце в перфузионную камеру горизонтально передней стороной вверх. Поместите канюлю на кусок сарды. Закрепите канюлю U-образными штифтами, вставленными через кусок сарды в силиконовое дно перфузионной чашки.

Это предотвратит движение сердца. Во время визуализации можно использовать небольшую булавку от насекомых для стабилизации верхушки, если это необходимо, измерить количество раствора, используемого во время канюляции, и заменить его свежим раствором, чтобы общий циркулирующий раствор оставался на уровне двух литров. Теперь полностью погрузите электроды ЭКГ в ванну по обе стороны от сердца, но не соприкасайтесь с сердцем.

Затем убедитесь, что это делает нормальным отведение с одной морфологией ЭКГ. Между тем, поддерживайте давление в аорте на уровне от 60 до 70 миллиметров ртутного столба, регулируя расход перфузов в диапазоне от 25 до 35 миллилитров в минуту. Теперь выключите свет в комнате и добавьте от 0,3 до 0,6 миллилитров стокового раствора статинов BLEs в восьмерку PERFU для конечной концентрации от 10 до 20 микромоляров.

Через 10 – 15 минут сердечные сокращения должны прекратиться. Затем переключитесь на систему малого объема. Одним из ключей к успешной визуализации кальция SR является правильная загрузка потока красителя в пять N-ам.

Для этого требуется небольшая объемная перфузия для достижения высокой концентрации красителя и условий комнатной температуры. Чтобы избежать этерификации D в цитозоле, теперь приготовьте 500 микролитров раствора для загрузки гриппа O five N am и смешайте его с 500 микролитрами дорожного раствора. Затем прибавляем его к восьмерке PERFU.

Дайте загрузке продолжаться в течение 45 минут, а затем включите циркуляционную водяную баню, чтобы прогреть систему до 37 градусов по Цельсию. После часа загрузки переключитесь обратно на больший объем Perfu eight. Далее смешайте 50 микролитров чувствительного к напряжению красителя RH 2 37 с миллилитром теплого тироса.

Медленно вводите его в систему в течение примерно пяти минут и приступайте к оптическому картированию сердца. Для начала сфокусируйте камеры оптического картографирования на соответствующем поле, чтобы уменьшить движение на поверхности PERFU eight. Нанесите на раствор крышку-колпак

Теперь отрегулируйте светодиодный луч света, чтобы обеспечить равномерное освещение сердца. Для каждой оптической записи установите нужный протокол темпа. Включите индикатор возбуждения и соберите данные за одну-четыре секунды в течение одного-двух часов.

Шум от вытекшего красителя поставит точку в эксперименте. Затем промойте систему деионизированной водой. Затем 70% этанола и в завершение еще одним полосканием деионизированной водой.

С помощью описанного протокола можно разделить спектральное разделение трансмембранного потенциального сигнала и саркоплазматического ретикулума или кальциевого сигнала SR. Также были зарегистрированы оптические следы при непрерывном темпе. Затем на основе данных были построены карты активации путем построения графика времени активации каждого пикселя.

На изохрональном графике существует типичная задержка от восьми до 10 миллисекунд между двумя сигналами. Оказалось возможным количественно оценить относительное изменение диастолического SR. Кальциевая нагрузка и систолическая SR кальций высвобождают амплитуды при различных циклах стимуляции. Патологическое обращение с кальцием SR наблюдалось после применения агониста бета-адренорецепторов изопротеренола.

Красные стрелки указывают на явную утечку кальция из sr. В этих условиях может происходить опосредованное кальцием срабатывание потенциалов действия. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как проводить одновременное оптическое картирование трансмембранного потенциала и сигналов кальция SR в неповрежденном сердце кролика Lang Endorf Perfused.