Assay набора клетки опухоли легких
26 февраля 2019 г.
Эта рукопись описывает метод количественной оценки накопления клеток опухоли в легких в животной модели метастазов опухоли.
Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биологии опухоли о молекулярных механизмах метастазирования. Основным преимуществом этого метода является то, что набор опухолевых клеток в удаленном органе может быть количественно. Начните с использования не-энзиматической диссоциации клеток реагент для удаления флуоресцентных белков-экспрессирующих Льюиса карциномы легких, или ООО, клетки из их контейнера культуры в соответствии со стандартными протоколами.
Перенесите полученный клеточный раствор в 15-миллилитровую коническую трубку перед центрифугой, а центрифугу промыть гранулы два раза в пять миллилитров PBS на стирку. После второй стирки, фильтровать клетки через 40-микрометровый поры клетки ситечко, и разбавить подвеску в один раз от 10 до шести клеток на миллилитр концентрации. Затем загрузите клетки в одноми миллилитровый шприц, оснащенный иглой 29-го калибра, и ввейте 100 микролитров клеток в хвостовую вену каждой мужской мыши в возрасте от восьми до 10 недель, C57-Black-6.
В соответствующей экспериментальной конечной точке используйте ножницы, чтобы удалить кожу с брюшной поверхности каждой мыши, и вырезать ребра и диафрагму, чтобы разоблачить грудной полости. Используйте 25-го калибра крылатые инфузионные иглы и трубки, чтобы промыть 15 миллилитров PBS через правый желудочек, и удалить сердце и тимус. Сжимая трахею типсами, подтягивайтесь, рассекая соединительные ткани вокруг трахеи, чтобы собрать легкие.
Затем мыть легкие в PBS, и отделить одну долей для визуализации флуоресцентных клеток на месте под флуоресцентным микроскопом. Чтобы переварить легочную ткань, сначала нарежьте ножницами хвостовую долей и поместите кусочки легких в 10-миллилитровый шприц. Закройте шприц с поршенем, и аспирировать пять миллилитров раствора пищеварения в шприц, перемещая поршень в и из вала шприца, пока легочная ткань распространяется по всему раствору.
Разпределите легочную суспензию в 50-миллилитровую трубку и усваиваете ткань на взаимном шейкере в течение 15 минут при 37 градусах Цельсия и 150 об/мин. В конце инкубации, тритурировать оставшиеся ткани, пока клетки легких полностью рассеяны, и вернуть трубку шейкер в течение еще 30 минут. Затем фильтровать клетки через 40-микрометровый ситечкой поры, и собирать клетки путем центрифугации.
Чтобы проанализировать изолированные клетки легких путем цитометрии потока, повторно посовестить гранулы в двух миллилитров буфера лиза красных кровяных телец в течение одной минуты при комнатной температуре, и собирать клетки центрифугации. Затем центрифуга гранулы два раза в пять миллилитров свежего PBS дополняется 1%бычьей сыворотки альбумин на стирку. После второй центрифугации, повторно гранулы в один миллилитр свежего PBS плюс BSA, и фильтровать клетки через новый 40-микрометровый ситечко поры для количественной оценки опухолевых клеток по цитометрии потока.
Легкие представляют много клеток GFP-LLC через два часа после инъекции, при этом подавляющее большинство клеток исчезает из легких в течение 24 часов. Обратите внимание, что любые флуоресцентные пятна, обнаруженные в красном фильтре, должны быть исключены из списка клеток. Для подтверждения количества GFP-LLC в легких, одна из долей может быть использована для цитометрического анализа потока, как попродемонстрировано.
При попытке этой процедуры, важно помнить, что замороженные процедуры раздела является более точным методом для наблюдения точное местоположение опухолевых клеток.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной рукописи описывается метод количественного определения накопления опухолевых клеток в легких на животной модели метастазирования опухоли. Этот метод позволяет количественно оценить рекрутирование опухолевых клеток в удаленный орган, что дает представление о молекулярных механизмах метастазирования.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Онкология
- Клеточная биология
Теоретические сведения
- Понимание механизмов метастазирования опухолей имеет решающее значение для исследований рака.
- Количественная оценка накопления опухолевых клеток может дать важные биологические сведения.
- Использование животных моделей является общепринятой практикой при изучении прогрессирования рака.
- Клетки, экспрессирующие флуоресцентные белки, облегчают отслеживание и количественный анализ.
Цель исследования
- Разработка метода количественной оценки накопления опухолевых клеток в легких.
- Исследование рекрутирования опухолевых клеток в модели метастазирования.
- Углубление понимания молекулярных механизмов, лежащих в основе метастазирования.
Используемые методы
- Использование неферментативного реагента для диссоциации клеток.
- Центрифугирование и промывка клеточного осадка в PBS.
- Фильтрование клеток через клеточный фильтр с размером пор 40 µm.
- Инъекция разведенной клеточной суспензии в хвостовую вену мышей.
Основные результаты
- Данный метод позволяет эффективно количественно определить накопление опухолевых клеток.
- Продемонстрирована возможность отслеживания опухолевых клеток in vivo.
- Получены данные о динамике привлечения опухолевых клеток.
- Внесен вклад в понимание метастатических процессов.
Выводы
- Данный метод является ценным инструментом для изучения биологии опухолей.
- Он расширяет возможности исследования метастазирования на моделях животных.
- Будущие исследования могут опираться на эту методику для поиска терапевтических мишеней.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Данный анализ позволяет количественно оценить привлечение опухолевых клеток в отдаленные органы, что способствует снижению механистических рисков при поиске лекарственных препаратов, направленных на борьбу с метастазированием. Минуя этапы инвазии первичной опухоли, этот метод фокусируется на взаимодействиях со стромой и процессах экстравазации, которые имеют решающее значение для доклинической валидации мишеней. Метод обеспечивает воспроизводимый и масштабируемый результат для оценки антиметастатических соединений in vivo.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверить терапевтические гипотезы о вкладе стромы в метастазирование в отдаленные органы.
- Практическая ценность: обеспечивает функциональную валидацию мишеней путем количественного определения накопления опухолевых клеток в легких после инъекции.
- Прогностическая ценность: способствует приоритизации портфеля препаратов путем измерения влияния соединений на динамику рекрутирования опухолевых клеток.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: обеспечивает получение стандартизированных количественных результатов с помощью проточной цитометрии для проведения кампаний по скринингу соединений.
- Воспроизводимость: использование определенных концентраций клеток и объемов инъекций гарантирует согласованность моделирования метастазирования.
- Масштабируемость: совместимость с многолуночной обработкой и высококонтентным анализом для снижения рисков при определении мишеней.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для заболевания: Моделирование микрометастазов в легких для изучения механизмов органоспецифической колонизации.
- Трансляционная преемственность: Связь результатов фундаментальных исследований с доклинической валидацией антиметастатических средств.
- Принятие решений с учетом рисков: Обоснование критериев принятия решения о продолжении или прекращении исследования (go/no-go) на основе снижения количества меченых опухолевых клеток.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Этапы в континууме разработки лекарственных средств — от проверки гипотез относительно мишеней до оптимизации соединений-лидеров, — позволяющие проводить количественную оценку соединений, модулирующих метастазирование.
- Фундаментальная биология: обеспечивает возможность изучения механизмов взаимодействия опухоли и стромы в метастатических нишах.
- Скрининг: позволяет получать количественные данные на основе флуоресценции для валидации хитов в анализах метастазирования.
- Аналитика: генерирует данные о количестве опухолевых клеток с помощью проточной цитометрии для анализа зависимости «доза-эффект» и статистической обработки.
- Трансляционные исследования: согласуется со стратегиями поиска биомаркеров путем отслеживания диссеминации меченых клеток in vivo.
- Корпоративное повторное использование: создает многоразовую платформу для междисциплинарных исследований механизмов метастазирования в рамках различных проектов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Снижает механистическую неопределенность путей метастазирования за счет количественной оценки органоспецифического привлечения клеток.
- Операционная ценность: Стандартизирует доставку опухолевых клеток и обработку тканей для обеспечения воспроизводимости при межлабораторных сравнениях.
- Стратегическая ценность: Повышает эффективность использования капитала, обеспечивая раннее снижение рисков при разработке терапевтических средств, нацеленных на метастазирование.
- Влияние на портфель: Облегчает принятие решений о продвижении проектов с учетом рисков на основе доклинических данных о подавлении метастазирования.
Особенности реализации
- Требуются навыки проведения инъекций в хвостовую вену мышей и методы диссоциации тканей.
- Метод зависит от оборудования для проточной цитометрии и контролей компенсации флуоресценции.
- Необходимы стандартизированные протоколы подготовки клеток для всех исследовательских групп.
- Требуется оптимизация дозы клеток во избежание получения искаженных сигналов из-за избыточного накопления в легких.
- Метод ограничен количественным определением накопления в легких; он не позволяет зафиксировать первичную инвазию опухоли или последующий метастатический рост.
