Доставка белки, пептиды или сотовых непроницаемый малых молекул в живых клетках при инкубации с эндосомолитического реагента dfTAT

Общая цель следующего эксперимента заключается в доставке макромолекул в живые клетки с использованием димерного флуоресцентного tat или df tat — реагента, который может очень эффективно проникать в клетки, не повреждая их. Это достигается путем первоначального получения и очистки агента доставки, за которым следует второй этап — использование Dfta.

Dfta инкубируют с клетками в течение одного часа при 37 °C в присутствии интересующего макромолекулярного груза; df tat индуцирует поглощение груза внутрь эндоцитозных везикул. Везикулы созревают в ранние эндосомы и в конечном итоге достигают стадии поздних эндосом, где DF tat может высвободить груз в цитозоль клеток. Затем клетки визуализируют с помощью флуоресцентной микроскопии для оценки эффективности доставки detta и интересующего груза.

Результаты показывают, что DF TT может проникать в клетки с высокой эффективностью и без заметной цитотоксичности; DF tat способен доставлять макромолекулы различных размеров в цитозоль клеток, что можно наблюдать с помощью флуоресцентной микроскопии. Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими способами доставки твердыми агентами является высокая эффективность доставки нашего агента при отсутствии заметного негативного влияния на физиологию клеток. Кроме того, метод прост в использовании, так как требует лишь одного простого этапа совместной инкубации.

Для начала синтеза FTA набухните 500 мг R-амидной смолы MBHA в диметилформамиде (DMF) в стандартном сосуде для SPPS объемом 50 мл в течение одного часа; проводите реакцию при комнатной температуре, используя азот в объеме, достаточном для барботирования реакционной смеси. Синтезируйте FTA на R-амидной смоле MBHA, используя по 1,2 ммоль каждой FM-защищенной аминокислоты, указанной в текстовом протоколе, для каждой реакции сочетания аминокислот. Также добавьте 0,44 г HBTU и 0,51 мл DIEA, растворенных в DMF; проводите каждую реакцию сочетания аминокислот в течение четырех часов. После четырехчасового сочетания

Промойте смолу DMF и выполните стадию защиты FD, как описано в текстовом протоколе. Повторяйте процедуру до тех пор, пока не будет синтезирована линейная пептидная цепь FTA. Затем удалите защитную группу MTT, инкубируя смолу в течение пяти минут с 20 миллилитрами раствора, состоящего из 1% трифторуксусной кислоты (TFA) и 2% триизопропилсилана (TIS) в DCM.

Поскольку удаление защитной группы MTT приводит к появлению желтого цвета, повторяйте процедуру до тех пор, пока желтый цвет не исчезнет, промывая смолу между этапами растворами DCM и DMF. Добавьте к смоле дополнительный раствор 1% TFA в DCM, чтобы убедиться, что MTT больше не удаляется и раствор остается прозрачным.

Затем растворите T-M-R-H-B-T-U и DIEA в DMF и добавьте эту смесь к смоле. Проводите реакцию в течение ночи в среде сухого азота при постоянном перемешивании после защиты Fmoc и конъюгации аминокислоты. Промойте смолу DCM и дайте ей высохнуть для полного отщепления пептида от смолы.

Добавьте к пептидной смоле раствор, содержащий 92,5% TFA, 2,5% воды, 2,5% TIS и 2,5% этандитиола, и выдержите в течение трех часов при комнатной температуре для полного снятия защитных групп и отщепления пептида от смолы. Осадите сырые пептидные продукты с помощью холодного безводного этилового эфира, слив приготовленный раствор в 40 миллилитров этилового эфира. Центрифугируйте осадок при температуре four degrees Celsius и 4 000 G в течение 20–25 минут.

Повторите этот шаг, чтобы промыть осадок холодным безводным этиловым эфиром. Суспендируйте осадок в воде и лиофилизируйте, затем снова ресуспендируйте полученные продукты в 0,1% водном растворе TFA ACEDONITE. Проведите анализ методом высокоэффективной жидкостной хроматографии или ВЭЖХ с использованием аналитической колонки C 18.

Для анализа каждого пептида используйте скорость потока 1 мл/мин и детектирование при 214 нм и 550 нм. Затем проведите полупрепаративную ВЭЖХ на колонке C 18 для очистки пептидов. Для всех циклов используйте скорость потока 4 мл/мин и детектирование при 214 нм и 550 нм.

Перед проведением реакции окисления используйте линейные градиенты. Подтвердите подлинность пептидов методом MALDI в соответствии с протоколом производителя. Растворите FTA в аэрированном фосфатно-солевом буфере.

Убедитесь, что pH находится в диапазоне от 7.0 до 7.5. После добавления пептида оставьте реакционную смесь на ночь для полного завершения реакции. Очистите продукт с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ и проанализируйте методом масс-спектрометрии, как описано ранее; лиофилизируйте чистый DF tat и ресуспендируйте в 200 µL воды для измерения концентрации.

Сначала ресуспендируйте аликвоту очищенного DF tat в 149 µL 50 мМ раствора TCEP и дайте образцу прореагировать в течение примерно 20 минут. На этом этапе DF tat восстанавливается до своего мономерного аналога F tat, чтобы устранить тушение поглощения, которое происходит из-за тесного сближения TMR fluor 4 и DF tat. Перенесите все растворы в кварцевую кювету и измерьте абсорбцию при 556 нм.

Используя закон Бугера — Ламберта — Бера, определите концентрацию раствора. Это значение соответствует концентрации fta.

Разделите концентрацию FTA на два, чтобы получить концентрацию dfta. Культивируйте клетки в подходящей среде до достижения 80–90% конфлюэнтности в увлажненной атмосфере при 37 °C с содержанием 5% CO2, затем трижды промойте клетки 200 µL PBS и один раз NRL 15. Инкубируйте клетки с 5 µM df tat с грузом (например, усиленным зеленым флуоресцентным белком) или без него при 37 °C в течение одного часа для индукции эндосомальной утечки после инкубации.

Трижды промойте клетки гепарином в среде L 15, чтобы удалить DF tat, связавшийся с плазматической мембраной клеток. На заключительном этапе визуализируйте клетки с помощью флуоресцентного микроскопа, используя фильтр для красного флуоресцентного белка или RFP-фильтр для оценки различий между F TAT и D ftt. Клетки HeLa инкубируют с каждым пептидом для определения различий в их клеточной локализации.

Как показано здесь, FTA локализуется в виде точечного распределения. Такое распределение согласуется с тем, что пептид остается запертым внутри эндосом. Напротив, флуоресцентный сигнал dfta демонстрирует гомогенное распределение по всей цитозоле и ядру.

Цитозольное распределение DF tat наблюдается в ряде различных клеточных линий. Изображения с 20-кратным увеличением показывают, что очень высокий процент клеток в чашке демонстрируют цитозольное распределение DF tat без признаков клеточной токсичности, о чем свидетельствует отсутствие окрашивания ядер cyt blue; данный анализ проводился для определения того, способствует ли эндосомальная утечка, опосредованная dfta, доставке крупных белков в цитозоль клеток. Для обнаружения доставки правильно свернутого белка использовался EGFP.

EGFP демонстрировал распределение зелесной флуоресценции в цитозоле и ядре, аналогично наблюдаемому для DF tat в более чем 90% клеток без заметной токсичности. При выполнении данной процедуры важно помнить, что клетки не должны быть чрезмерно конфлюэнтными. Кроме того, перед добавлением df tap клетки следует тщательно промыть для удаления FPS.