Доставка белки, пептиды или сотовых непроницаемый малых молекул в живых клетках при инкубации с эндосомолитического реагента dfTAT

Общая цель данного эксперимента заключается в доставке макромолекул в живые клетки с помощью димера, флуоресцентного TAT или df tat реагента, который может очень эффективно проникать в клетки, не повреждая их. Это достигается путем первичной генерации и очистки агента доставки. Dfta в качестве второго шага.

Dfta инкубируется с клетками в течение одного часа при температуре 37 градусов Цельсия в присутствии интересующей макромолекулы груза, df tat индуцирует поглощение груза внутри эндоцитарных везикул. Везикулы созревают в ранние эндосомы, в конечном итоге достигая поздней стадии эндосом, где DF tat способен высвобождать груз в цитозольное пространство клеток. Затем клетки визуализируются с помощью флуоресцентной микроскопии, чтобы оценить эффективность доставки детты и интересующего груза.

Результаты показывают, что DF TT может проникать в клетки с высокой эффективностью и не имеет наблюдаемой цитотоксичности; DF TT может доставлять макромолекулы различных размеров в цитозольное пространство клеток, что можно наблюдать с помощью флуоресцентной микроскопии. Основное преимущество этой методики перед существующими подходами к твердой доставке заключается в том, что наш агент имеет высокую эффективность доставки без заметного негативного влияния на клеточную физиологию. Кроме того, он прост в использовании, так как требует всего лишь простой стадии совместной инкубации.

Для начала синтеза FTA набухают 500 миллиграммов Rамида, смолы MBHA и диметилформамида или DMF в стандартном 50-миллилитровом сосуде SPPS в течение одного часа, проводят реакцию при комнатной температуре, используя ровно столько газообразного азота, сколько нужно, чтобы реакция прогремела. Синтезируйте FTA на катковой амидной смоле MBHA, используя 1,2 миллимоля каждой FM-защищенной аминокислоты, указанной в текстовом протоколе, для каждой реакции аминокислотного соединения. Также добавьте точку 44 грамма HBTU и точку 51 миллилитр растворенного в DMF DIEA, проводите каждую реакцию аминокислотного соединения в течение четырех часов после четырехчасового соединения.

Промойте смолу DMF и выполните этап защиты FD, как описано в текстовом протоколе. Повторяйте до тех пор, пока не синтезируется линейная пептидная цепь FTA. Затем Клеве защитную группу МТТ инкубируют смолу с 20 миллилитрами раствора, состоящего из 1% тритрифтористоуксусной кислоты или ТЖК и 2%-го триизопропила или ТИС в ДКМП в течение пяти минут.

Так как удаление защитной группы МТТ приведет к появлению желтого цвета. Повторяйте это до тех пор, пока не исчезнет желтый цвет, промывка смолы DCM и DMF между ними. Добавьте в смолу дополнительный раствор с 1% TFA в DCM, чтобы гарантировать, что MTT не будет удален и раствор останется прозрачным.

Далее растворяем T-M-R-H-B-T-u и DIEA в ДМФА и добавляем эту смесь в смолу. Проведите реакцию в течение ночи с использованием сухого азота для обеспечения перемешивания после fm d защиты и конъюгации аминокислот. Промойте смолу DCM и дайте ей высохнуть для полного отщепления пептида от смолы.

Добавьте раствор, содержащий 92,5% TFA, 2,5% воды, 2,5% TIS и 2,5% этана диола, в пептидиловую смолу в течение трех часов при комнатной температуре, чтобы достичь общей глубокой защиты и расщепления от смолы. Осаждение сырых пептидных продуктов с помощью холодного безводного этилового эфира путем слива приготовленного раствора до 40 миллилитров эйлового эфира. Уменьшите его при температуре 4 градуса Цельсия и 4 000 G в течение 20-25 минут.

Повторите этот шаг, чтобы дать возможность смыть осадок холодным безводным этиловым эфиром reus. Суспендировать осадки в воде и лиофилизировать, затем повторно суспендировать продукты, полученные в исследовании 0,1%-ного водного раствора TFA ACEDONITE. Выполняйте высокопроизводительную жидкостную хроматографию или анализ ВЭЖХ с помощью аналитической колонки C 18.

Для анализа каждого пептида используйте скорость потока один миллилитр в минуту и обнаружение на глубине 214 нанометров и 550 нанометров. Затем выполните полупрепаративную ВЭЖХ на колонке C 18 для очистки пептидов. Используйте скорость потока четыре миллилитра в минуту и обнаружение на 214 нанометрах и 550 нанометрах для всех прогонов.

Используйте линейные градиенты перед проведением реакции окисления. Подтвердите правильную идентичность пептидов с помощью MALDI в соответствии с протоколом производителя. Растворите FTA в аэрированном фосфатном буферном растворе.

Убедитесь, что pH находится в диапазоне от 7,0 до 7,5. После добавления пептида мутируйте реакцию в течение ночи, чтобы дать ей вступить в реакцию до завершения. Очистите продукт с помощью ВЭЖХ с обратной фазой и проанализируйте с помощью масс-спектрометрии, как и перед этим, лиофилизируйте чистый DF тат и суспендируйте в 200 микролитрах воды для измерения концентрации.

Сначала Resus суспендирует аликвоту очищенного DF tat в 149 микролитрах 50 миллимолярного раствора TCEP, дает образцу вступить в реакцию в течение примерно 20 минут. На этом этапе DF tat восстанавливается до его мономерного аналога F tat для устранения гашения абсорбции, которое происходит из-за непосредственной близости четвертого этажа TMR и DF tat. Сложите все растворы в кварцевую CVE и измерьте поглощение на 556 нанометрах.

Используя закон пива. Определите концентрацию раствора. Это соответствует концентрации fta.

Разделите концентрацию FTA на два, чтобы получить концентрацию dfta. Выращивайте клетки в подходящей среде до 80-90% плавности в влажной атмосфере при температуре 37 градусов Цельсия, содержащей 5% CO2, промойте клетки три раза 200 микролитрами PBS и один раз NRL 15. Инкубируйте клетки с пятью микромолярами df tat с грузом или без него, таким как усиленный зеленый флуоресцентный белок, и выдерживайте при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа, чтобы вызвать эндосомальную утечку после инкубации.

Трижды промойте клетки гепарином в среде L 15 для удаления DF tat, связанного с плазматической мембраной клеток. В качестве заключительного этапа изображения клетки с помощью флуоресцентного микроскопа получают изображение DF tat с использованием красного флуоресцентного белка или фильтра RFP для оценки разницы между F TAT и D ftt. Клетки пятки инкубируются с каждым пептидом, чтобы определить разницу в их клеточной локализации.

Как показано здесь, FTA локализуется в точечном распределении. Такое распределение согласуется с тем, что пептид остается в ловушке внутри эндосом. Напротив, флуоресцентный сигнал dfta демонстрирует однородное распределение по всему цитозолю и ядру.

Цитозольное распределение DF tat наблюдается в ряде различных клеточных линий. 20 изображений показывают, что очень высокий процент в чашке демонстрирует цитозольное распределение DF tat без клеточной токсичности, что видно по окрашиванию ядра без цитового синего цвета, чтобы определить, доставляет ли опосредованная dfta эндосомальная утечка большие белки в цитозоль клеток. EGFP использовали для определения доставки правильно свернутого белка.

EGFP продемонстрировал цитозольное и ядерное зеленое флуоресцентное распределение, аналогичное тому, которое наблюдается для DF tat в более чем 90% клеток без наблюдаемой токсичности. Кроме того, элементы должны быть тщательно промыты для удаления FPS перед добавлением df tap.