Оценка чувствительности и Perigenital простаты тучных клеток активации в мышиной модели новорожденных материнской разъединении

Общая цель данного эксперимента состоит в том, чтобы определить влияние стресса в раннем возрасте на мочеполовую систему путем измерения перигенитальной механической чувствительности и активации тучных клеток в предстательной железе у самцов C 57 черных шести мышей, которые подверглись отделению новорожденных от матери. Это достигается путем первого проведения неонатального разделения матерей на пометах из шести детенышей черных мышей C 57, чтобы вызвать стресс в раннем возрасте в течение 20 дней подряд. Вторым шагом является измерение перигенитальной механической чувствительности путем наложения серии мононитей фон Фре на перигенитальную область.

Далее проводится окрашивание подкисленным толуидиновым синим цветом на участках криостата предстательной железы мышей. Для количественной оценки активации тучных клеток. Результаты показывают, что отделение матери у новорожденных увеличивает перигенитальную механическую чувствительность и активацию тучных клеток протеза на основе нашего поведенческого и гистологического анализов.

Основное преимущество этой методики перед существующими методами, такими как экспериментальный аутоиммунный простатит, заключается в том, что она включает в себя воздействие стресса во время раннего развития, что ускоряет симптоматику в более позднем возрасте, подобно тому, как это наблюдается у пациентов с хроническим простатитом. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области хронической тазовой боли, такие как влияние стресса в раннем возрасте на поведение, и предоставить гистологические доказательства измененных болевых состояний. Хотя этот метод может дать представление о хроническом простатите, он также может быть применен к другим функциональным болевым синдромам, таким как интерстициальный цистит, синдром болезненного мочевого пузыря, вульводиния, фибромиалгия или мигрень.

Его можно даже применять при других распространенных психологических сопутствующих заболеваниях, таких как тревога и депрессия На следующий день после рождения извлеките самку из домашней клетки и поместите ее в чистый вторичный контейнер. Потрите горсть подстилки между чистыми руками в перчатках, чтобы сохранить запах домашней клетки, а затем перенесите глубину от одного до двух сантиметров подстилки в чистую двухлитровую стеклянную колонку с соответствующей маркировкой. Кроме того, примерно половину любого дополнительного материала подстилки, присутствующего в домашней клетке, такого как гнезда или мягкая бумага для стеклянной колонки по отдельности, поместите всех щенков из одного помета в подготовленный стакан и немедленно поместите стакан при температуре 33 градуса Цельсия и влажности 50% на 180 минут.

Во время отделенного инкубационного периода извлеките самку из вторичной емкости и верните ее в домашнюю клетку. Верните домашнюю клетку на надлежащее место в виварии. По окончании периода разделения достаньте домашнюю клетку и снимите плотину, поместив ее в чистый вторичный контейнер.

Затем выньте стакан из инкубатора и бросьте горсть подстилки между чистыми руками в перчатках, чтобы сохранить запах домашней клетки во время работы со щенками. Осторожно переместите щенков по отдельности из стакана в домашнюю клетку и верните все остатки обогащения и подстилки в домашнюю клетку. После того, как все щенки будут возвращены, переместите самку из вторичного контейнера в домашнюю клетку и верните ее на надлежащее место содержания в виварии.

Повторяйте всю эту процедуру для каждого помета, подвергающегося отделению матери от новорожденных, каждый день до 21-го дня после рождения. Затем отлучите щенков от груди и разместите их в тех же условиях, что и контрольные мыши, на протяжении всего эксперимента. Подготовьте испытательную зону, поместив впитывающую пеленку под приподнятым столом из проволочной сетки высотой 55 сантиметров.

Стол должен обеспечивать достаточно места, чтобы следователь мог подойти к нему снизу, не пугая мышей. Поместите до 12 восьминедельных мышей по отдельности под прозрачные перфорированные пластиковые камеры на столе из проволочной сетки. Поместите тяжелый предмет на верхнюю часть камер, чтобы мыши не смогли сбежать.

Возьмитесь за основание трехконечной 22-граммовой мононити фон рамы и обнажите втянутую мононить. Расположите зонд так, чтобы мононить была вертикально ориентирована. Когда мышь бдительна, неподвижна и вес ее тела равномерно распределяется между задними лапами.

Нанесите его либо на левую, либо на правую сторону мошонки, избегая средней линии, пока в нити не будет наблюдаться небольшой изгиб. Удерживайте мононить на месте в течение 10 секунд или до тех пор, пока животное не проявит положительную реакцию, такую как резкий рывок или прыжок, облизывание или укус, направленный на мононить. Если мышь не двигается и не проявляет никаких положительных реакций во время десятисекундного применения мононити, запишите отрицательный тест всех мышей, использующих нить того же размера, а затем переключитесь на следующую подходящую мононить.

Продолжайте тестировать каждую мышь, используя следующую большую или меньшую мононить в зависимости от необходимости для дополнительных четырех применений. После того, как будет замечен первый положительный ответ, препарируйте, а затем сделайте криорез, зафиксированную ткань предстательной железы девятинедельных мышей на криорезы толщиной семь микрон. Затем приготовьте 1%-ный стоковый раствор толуидина, добавив один грамм толуидинового синего O к 100 миллилитрам 70%-ного этанола, и перемешайте смесь до тех пор, пока она не перейдет в раствор.

Храните исходный раствор при комнатной температуре до трех недель. В другой стакан добавьте один грамм хлорида натрия на 100 миллилитров воды, помещенной на тарелку для перемешивания. Отрегулируйте pH солевого раствора с помощью 12 молярной соляной кислоты до тех пор, пока не будет достигнут диапазон pH от 0,5 до 1,0.

Затем приготовьте 0,25% подкисленный рабочий раствор Toine blue, смешав восемь миллилитров стокового раствора Udine blue и 32 миллилитра кислого 1%-ного раствора хлорида натрия. Двигайте его вверх и вниз, чтобы обеспечить полное включение исходного синего исходного раствора, и перемешивайте Используя вихрь, готовьте рабочий раствор свежим для каждой партии слайдов. Промойте срезы ткани, по отдельности погрузив предметные стекла примерно на одну секунду в коническую трубку объемом 50 миллилитров, содержащую достаточный объем PBS для полного погружения ткани.

Дайте слайдам высохнуть на воздухе на бумажном полотенце. Затем поместите предметные стекла в стеклянную банку, содержащую достаточное количество рабочего раствора 0,25% толуидина, чтобы срезы тканей были полностью погружены в воду. Инкубируйте горки в течение 10–15 минут, находясь на качалке платформы, установленной на 15 оборотов в минуту.

Затем опустите слайды в PBS примерно на одну секунду, чтобы смыть излишки высокого синего цвета, и поместите слайды в слайд-бокс так, чтобы слайды лежали на боку. Для обеспечения дренажа. Сушите слайды в духовке при температуре 37 градусов Цельсия не менее двух часов или в течение ночи при комнатной температуре.

После высыхания погрузите предметные стекла в 95% этанол примерно на одну секунду, а затем дайте секции полностью высохнуть. Повторяйте эту процедуру от одного до 10 раз, пока ткань не высохнет сильнее синего, чем фиолетового. Затем погрузите предметные стекла в 100% этанол примерно на одну секунду и дайте сечению полностью высохнуть.

Повторите эту процедуру от одного до 10 раз, пока ткань не станет темно-синей, но не фиолетовой. Наконец, зафиксируйте пятно, инкубировав предметные стекла в 100% ксилоле в течение трех минут. Дайте им высохнуть, а затем накройте, наденьте слайды с глицерином PPS или постоянным монтажным материалом на основе ксилола.

Слейте лишний материал и храните готовые слайды при комнатной температуре. При тестировании с помощью градуированной серии мононитей фон Фрейма, восьминедельных новорожденных при разлучении матерей, у мышей наблюдалась перигенитальная механическая аллодиния по сравнению с наивными аналогами. Об этом свидетельствует значительное снижение порога механической абстиненции, что вызвало положительную поведенческую реакцию.

Дополнительные доказательства хронического простатита, синдрома хронической тазовой боли можно увидеть: гистологически показаны срезы криостата тканей предстательной железы, которые были окрашены подкисленным толуидиновым синим, чтобы наблюдать гранулы триптазы, размещенные внутри тучных клеток. Значительно более высокий процент дегранулированных тучных клеток наблюдался в срезах предстательной железы у неонатальных мышей, подвергшихся разделению. По сравнению с наивными мышами Во время проведения неонатального отделения матери важно помнить о необходимости сохранять запах домашней клетки, чтобы мать не отвергла щенков

Другие методы, такие как тестирование в открытом поле или выбор жидкости с двумя вариантами выбора, могут быть использованы для оценки поведенческих доказательств коморбидных расстройств настроения. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как оценить перигенитальную механическую чувствительность и активацию тучных клеток предстательной железы как поведенческие и гистологические доказательства хронического простатита и мышей после разлучения новорожденных матерей.